去整合素金属蛋白酶10基因启动子区多态性变化与腔隙性脑梗死发病风险的关系

李 友，廖 锋，崔理立，马国达，李克深

(广东医学院附属医院衰老与心脑疾病相关重点实验室暨神经病学研究所，广东湛江524001)

脑卒中是严重危害人类健康和生命的疾病，其发病率、致残率及病死率均高，其中缺血性脑卒中占80%以上［1］。遗传因素和环境因素共同参与脑卒中的发生。由脑内小血管闭塞导致的腔隙性脑梗死是脑卒中最常见的一种类型，其与脑内大中血管闭塞所致大动脉粥样硬化性脑梗死(ACI)可能存在不同的遗传学机制。尽管腔隙性脑梗死病变面积不大，仍可造成严重功能障碍，并可能是血管性痴呆的病因。去整合素金属蛋白酶(ADAMs)家族为Ⅰ型跨膜蛋白，参与细胞增殖分化及胞外基质重建、血管形成、细胞迁移等，与炎症、恶性肿瘤、阿尔茨海默病(AD)及动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程相关［2］。ADAM10是ADAM家族的重要成员，越来越多的证据表明其可能在动脉粥样硬化的形成和发展过程中起重要作用［3］。ADAM10基因启动子区的多态性可调节其表达［4］，且已被证实与AD及行为紊乱等疾病相关［5，6］。目前，国内外有关 ADAM10多态性与腔隙性脑梗死的相关报道鲜见。本研究采用病例对照方法分析了ADAM10基因启动子区多态性与腔隙性脑梗死的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象为2011年2月～2012年9月于我院神经内科诊治的173例腔隙性脑梗死患者(梗死组)，男117例，女56例;年龄(69.89± 9.78)岁，其中≥70岁96例、＜70岁77例。均符合全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准，并经头颅CT/MRI检查证实，梗死灶直径均＜15 mm。对照组为297例性别及年龄匹配的本院非心脑血管疾病门诊体检者，男192例，女105例;年龄(69.67± 8.63)岁，其中≥70岁151例、＜70岁146例。剔除标准:伴房颤、血液病、结核、恶性肿瘤、大动脉炎、周围血管疾病、周围血管栓塞性疾病及严重肝肾功能不全者。该研究得到医院伦理委员会批准，受试者均被告知研究目的，并签署知情同意书。

1.2 基本资料收集及检测 通过问卷访谈收集两组吸烟史、高血压史、糖尿病史，采用自动化酶标仪测定血糖、血脂水平。

1.3 ADAM10基因启动子区多态性检测

1.3.1 血液标本采集及基因组DNA提取 两组均禁食12～14 h，抽取清晨空腹外周静脉血3～5 mL，EDTA抗凝后-20℃保存。取全血0.5 mL，按照北京天根公司血液基因组DNA提取试剂盒的说明提取基因组DNA，-20℃保存。

1.3.2 基因型检测 采用Snapshot法。选择已报道的ADAM10启动子区的多态位点 rs653765和rs514049［11］，在上海天昊生物科技有限公司进行基因型检测。用于多重PCR扩增的引物以Primer 3在线软件设计合成，具体序列:rs653765正义链为AGCACCTCCCTCTCGCTCCAC，反义链为TGCATTTATGTTCGCATCACTGG;rs514049正义链为AGCACCTCCCTCTCGCTCCAC，反义链为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAGAAAAAAAACCTCTGTTACTTGTGAC。PCR反应体系为20μL:10×HotStarTaq buffer 2.0μL，3.0 mmol/L的Mg2+4.0μL，上下游引物分别为20 pmol，0.3 mmol/L的dNTP 0.5 mmol，HotStarTaq polymerase 1.0 U，样本DNA 0.2～0.5 μg及灭菌去离子水适量，应用自动循环仪进行扩增;扩增条件:95℃2 min;94℃20 s，65℃40 s，72℃90 s，11个循环;94℃20 s，59℃30 s，72℃90 s，24个循环;72℃2 min;4℃保存。PCR产物纯化:在15μL的PCR产物中加入5 U虾碱酶(SAP)和2 U ExonucleaseⅠ酶，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min。基因型检测:①延伸产物(10μL)与1 U的SAP混合后于37℃孵育1 h，75℃灭活15 min;②取纯化后的产物0.5μL、9μL的 Hi-Di及0.5μL的Liz120混匀，95℃变性 5 min;③上样于ABI3130XL测序仪中，使用GeneMapper v4.1软件对实验结果进行分析。

1.4 颈动脉内膜中层厚度(CIMT)测量 采用B型彩色多普勒超声仪，探头中性频率为10 MHz。测量管腔与血管内膜交界面到血管中膜与外膜交界面之间的垂直距离(取不同位点最大值)，分别测量两侧颈总动脉前后壁值后取其平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。使用HWE程序检测Hardy-Weinberg平衡;基因型及等位基因频率均使用χ2检验或Fisher确切概率法进行分析;用独立样本t检验或χ2检验对各个危险因素进行分析;用方差分析评价ADAM10不同基因型与腔隙性脑梗死之间的关系;用独立样本t检验分析ADAM10基因多态性与CIMT的关系。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基本资料比较 梗死组吸烟史、高血压史比例及血糖水平均显著高于对照组(P均＜0.01)，高密度脂蛋白(HDL)和总胆固醇水平均显著低于对照组(P均＜0.01);两组甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)水平无显著差异(P均＞0.05)。

2.2 两组ADAM10基因启动子区多因型及等位基因频率比较 两组 ADAM10基因 rs653765和rs514049位点的基因型分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg平衡，可进行候选基因的关联分析。梗死组ADAM10基因rs653765位点CC基因型频率显著低于对照组(P=0.008 0)、隐性模型CT+TT基因型频率显著高于对照组(OR=0.54，95%CI为0.36～0.81，P=0.002 9)，T等位基因频率显著高于对照组(OR=1.95，95%CI为1.37～2.79，P=0.000 2);两组ADAM10基因rs653765位点的基因型频率和等位基因频率无显著差异(P＞0.05)。详见表1、2。

表1 两组ADAM 10基因rs653765位点基因型和等位基因频率比较(%)

表2 两组ADAM 10基因rs514049位点基因型和等位基因频率比较(%)

2.3 ADAM10基因多态性与不同性别人群腔隙性脑梗死发病风险的关系 梗死组和对照组男性隐性模型ADAM10基因rs653765位点CT+TT基因型频率分别为40.17%(47/173)、28.65%(55/297)，P =0.037(OR=0.60，95%CI为0.37～0.97)，T等位基因的频率分别为22.22%(52/173)、15.89% (61/297)，P=0.048(OR=1.51，95%CI为1.00～2.28)。ADAM10基因rs514049位点的多态性在两组男性与女性中均未见显著差异(P＞0.05)。

2.4 ADAM10基因多态性与不同年龄人群腔隙性脑梗死发病风险的关系 梗死组和对照组≥70岁者ADAM10基因rs653765位点CC基因型频率分别为67.71%(65/173)、80.79%(122/297)，组间比较有显著差异(P=0.041);隐性模型CT+TT基因型频率分别为32.29%(31/173)、19.21%(29/ 297)，P=0.019(OR=0.50，95%CI为0.28～0.90);T等位基因频率分别为17.19%(33/173)、10.93%(33/297)，P=0.046(OR=1.69，95%CI为1.00～2.85)。两组ADAM10基因rs514049位点的多态性在≥70岁及＜70岁者中均未见显著差异。

2.5 ADAM10基因多态性与梗死组CIMT的关系梗死组ADAM10基因rs653765位点基因型为CC及CT+TT者 CIMT分别为(0.135±0.047)、(0.127±0.028)cm，P=0.156;ADAM10基因rs514049位点基因型为AA及AC+CC者CIMT分别为(0.135±0.044)、(0.118±0.022)cm，P= 0.098。

3 讨论

腔隙性脑梗死是脑梗死亚型之一，是发生于脑深穿通动脉(或其他微小动脉)的缺血性微梗死，近年来其发病率持续升高。以往研究认为高血压是诱发此病最主要的原因，但目前认为除高血压引起小动脉壁脂质玻璃样变(玻璃样变动脉硬化)外，颅内穿支动脉粥样硬化也是重要病因［7］。ADAMs家族为一个包含了三十多个成员的家族，在调节细胞—细胞和细胞—基质的相互作用中至关重要。ADAM10为ADAM家族其中一员，其在许多与炎症相关的血管细胞包括内皮细胞、成纤维细胞、白细胞内均有所表达［8］;许多与ADAM10有关的底物，如TNF-α、白介素 6受体(IL-6R)、趋化因子配体CX3CL1及L选择素等，与脉管系统的发育、炎症和再生过程有关，而这些过程均被认为在动脉粥样硬化的发生、发展中具有重要作用。近年来研究［9］证实，ADAM10可通过介导TNF-α、趋化因子配体CXCL16及CX3CL1、CD44等多种细胞因子和趋化因子胞外结构域的脱落，参与血管生成、细胞迁移和反式迁移、黏附、炎症等过程，最终影响动脉粥样硬化的发生和发展。

ADAM10基因多态性已在许多神经系统的疾病中得到研究［6，10］。ADAM10基因 rs653765和rs514049位点的多态性被认为可调节AD患者淀粉样前体蛋白(APP)表达［4］。以往研究［11，12］显示，ADAM10基因翻译起始点上游-1～-2179 bp区域具有启动子活性，而其中的-300～-508 bp部分为其核心启动子区，而该启动子区内 rs653765与rs514049位点的多态性可影响AD患者的ADAM10和脑脊液中可溶性APPα水平表达，因而ADAM10基因rs653765位点C＞T多态性可能是一个功能性单核苷酸多态性(SNP)位点。生物信息学研究发现，ADAM10基因rs653765的C＞T多态位点上游1个碱基处有潜在的myc基因相关锌指结构蛋白(MAZ)转录因子的结合位点。本研究显示，AD-AM10基因rs653765位点的多态性与腔隙性脑梗死的发病相关，且携带rs653765位点CT基因型或T等位基因的人群，其患腔隙性脑梗死的风险显著升高。因此，ADAM10基因rs653765位点的C＞T多态性可能影响其与转录因子MAZ的结合，从而影响基因表达，而这些因素可能是潜在影响ADAM10基因多态性与腔隙性脑梗死发病风险相关的原因，但其详细机制有待进一步深入研究。

本研究针对性别和年龄亚组的研究发现，男性中携带ADAM10基因rs653765位点T等位基因者发生腔隙性脑梗死的风险比携带C等位基因者显著升高，≥70岁人群中携带ADAM10基因rs653765位点CT基因型或T等位基因者患腔隙性脑梗死的风险较C等位基因者显著升高。报道［13，14］显示，男性腔隙性脑梗死发病率较女性高。可能原因:女性体内的雌性激素有利于胆固醇及脂蛋白代谢;人体内导致细胞老化的自由基酶的基因定位于X染色体，故男性抗自由基损伤的能力比女性弱;男性更容易暴露于吸烟、饮酒等其他危险因素中，各危险因素之间相互叠加、相互作用［15］。CIMT增厚是动脉粥样硬化早期表现形式的一种［16］，主要由炎症等作用于动脉血管内壁，促使弹性纤维和胶原纤维等成分过度降解，最终导致细胞和细胞外基质积聚和血管重塑引起;因与动脉粥样硬化的进展及脑梗死的发病风险相关，被认为是脑梗死的强效预测因子［17］。本研究显示，ADAM10基因rs653765和rs514049位点的多态性与腔隙性脑梗死患者CIMT无明显相关。可能原因为以CIMT变化为表现形式的动脉粥样硬化早期病变中血管重塑并不明显。此外，尽管CIMT增厚、动脉粥样硬化斑块及脑梗死具有很多共同的危险因素，但这三者均为众多因素参与且互相影响而产生的不同病理现象。因此，以后需要对更大量的样本进行检测，以进一步探究ADAM10基因多态性对CIMT的影响。

综上所述，ADAM10基因rs653765位点T等位基因可能与腔隙性脑梗死的发病有关。

［1］Lo AC，Guarino PD，Richards LG，et al.Robot-assisted therapy for long-term upper-limb impairment after stroke［J］.N Engl J Med，2010，362(19):1772-1783.

［2］Edwards DR，Handsley MM，Pennington CJ.The ADAM metalloproteinases［J］.Mol Aspects Med，2008，29(5):258-289.

［3］Donners MM，Wolfs IM，Olieslagers S，et al.A disintegrin and metalloprotease 10 is a novel mediator of vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell function in angiogenesis and is associated with atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(11):2188-2195.

［4］Bekris LM，Lutz F，LiG，etal.ADAM10 expression and promoter haplotype in Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiol Aging，2012，33 (9):2229.e1-2229.e9.

［5］Jian XQ，Wang KS，Wu TJ，et al.Association of ADAM10 and CAMK2A polymorphisms with conduct disorder:evidence from family-based studies［J］.JAbnorm Child Psychol，2011，39(6): 773-782.

［6］Kim M，Suh J，Romano D，et al.Potential late-onset Alzheimer＇s disease-associated mutations in the ADAM10 gene attenuate{alpha}-secretase activity［J］.Hum Mol Genet，2009，18(20): 3987-3996.

［7］Del Bene A，Palumbo V，Lamassa M，et al.Progressive lacunar stroke:review of mechanisms，prognostic features，and putative treatments［J］.Int JStroke，2012，7(4):321-329.

［8］Dreymueller D，Pruessmeyer J，Groth E，etal.The role of ADAM-mediated shedding in vascular biology［J］.Eur JCell Biol，2012，91(6-7):472-485.

［9］van der Vorst EP，Keijbeck AA，deWinther MP，etal.A disintegrin and metalloproteases:molecular scissors in angiogenesis，inflammation and atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2012，224 (2):302-308.

［10］Song JH，Yu JT，Liu M，et al.Genetic association between ADAM10 gene polymorphism and Alzheimer＇s disease in a Northern Han Chinese population［J］.Brain Res，2011，(1421):78-81.

［11］Prinzen C，Muller U，Endres K，et al.Genomic structure and functional characterization of the human ADAM10 promoter［J］.FASEB J，2005，19(11):1522-1524.

［12］Bekris LM，Galloway NM，Millard S，et al.Amyloid precursor protein(APP)processing genes and cerebrospinal fluid APP cleavage product levels in Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiol Aging，2011，32(3):556.e13-23.

［13］张志坚，田亚莉.263例首次脑梗死的性别差异分析［J］.广东医学院学报，2008，26(3):270-271.

［14］Sharma JC，Fletcher S，Vassallo M.Characteristics and mortality of acute stroke patients:are there any gender differences［J］.J Gend Specif Med，2002，5(3):24-27.

［15］赵秀欣，张媛媛，林琅，等.不同性别脑梗死患者危险因素的比较［J］.中国脑血管病杂志，2009，6(3):129-133.

［16］Polak JF，Pencina MJ，O＇Leary DH，etal.Common carotid artery intima-media thickness progression as a predictor of stroke inmulti-ethnic study of atherosclerosis［J］.Stroke，2011，42(11):3017-3021.

［17］Ziegelbauer K，Schaefer C，Steinmetz H，et al.Clinical usefulness of carotid ultrasound to improve stroke risk assessment:ten-year results from the Carotid Atherosclerosis Progression Study(CAPS)［J］.Euro JPrev Cardiol，2013，20(5):837-843.