控制葡萄及其制品中赭曲霉毒素A的研究进展

王峻峻，张红印，王海英，杨其亚，李超兰

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013

赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的有毒代谢产物，包括A、B、C、D（α）四种化学结构非常相似的化合物，其中，赭曲霉毒素A（OTA）在自然界中最常见、毒性最强，对人类和动物的健康威胁最大。OTA的分子质量为403.8g/mol，是一种酸性很弱的有机酸，pKa为7.1；易溶于极性有机溶剂和碳酸氢钠溶液，微溶于水；OTA具有热稳定性，加工过程只能去除一小部分的OTA，甚至在250℃高温下都不能完全降解[1]。

OTA具有肾毒性，且有一定致癌、致畸、致突变性[2]。2004年国际癌症研究机构（IARC）将其划分为可能的人类致癌物，即2B类物质。由于OTA广泛存在于谷物、水果、饮料、咖啡等各种食品中，对人们的健康造成潜在的威胁，鉴于此，很多国家对其限量标准己经做了规定（见表1）[3-6]。1996年Zimmerli和Dick首次报道了在葡萄酒中检测出OTA，之后，澳大利亚、法国、西班牙等许多国家葡萄酒中都陆续检出OTA[7-10]。由于欧洲人有喜好喝葡萄酒的饮食习惯，因此在欧洲葡萄酒被认为是仅次于谷物，能使人感染OTA的第二大食品[11]。世界上50%的葡萄酒来自意大利，同时，欧洲的葡萄酒出口量占世界葡萄酒出口量的70%，这些地区的葡萄酒污染将会影响整个葡萄酒市场，这就意味着对OTA的控制是一个世界性的问题[3，12]。因此，有效控制和解决食品中，尤其是葡萄及葡萄制品中OTA的污染，对提高食品安全、保证人类健康有非常重要的意义。葡萄采前的严格规范的管理是最有效的控制OTA污染的方法，但是如果污染已经发生，必须采取一些适当的方法将其去除。本文主要从对OTA产毒菌以及对已经产生的OTA清除两个方面分析了控制OTA的方法。

表1 主要组织和国家规定的食品中OTA的限量标准Table1 Regulatory concentration limits for ochratoxin A in wine and related foods

1 葡萄及葡萄制品中OTA的污染现状

随着科技的发展以及人们对OTA毒性的认识，葡萄及其制品中OTA被普遍研究，由于地域等原因，OTA的污染状况轻重不一。Blesa等[13]通过对西班牙当地119个葡萄酒样品取样分析，发现OTA含量在＜0.01～0.76ng/m L。Serra等调查了葡萄牙11个葡萄园中的酿酒葡萄，只在3个葡萄园中检测出了OTA，含量为0.035～0.061μg/kg[14]。Mikulikova等调查了2009～2010年捷克南摩拉维亚州的葡萄酒污染情况，发现有11%的样品检测出了OTA，含量在1.2～71.2ng/L[15]。Vega等调查了智利2007～2009年间的葡萄酒，发现只有2.9%的酒样中含有OTA[16]。Brera等对意大利不同地域、不同品种的葡萄酒在1988～2004年间OTA的污染情况研究时，发现红葡萄酒中OTA的平均含量最高（7.50ng/m L），Var等在土耳其地区也发现红葡萄中OTA污染相对最为严重，且86%的葡萄酒样品中含有OTA，含量为＜0.006～0.815ng/m L[17-18]。而地中海地区的红葡萄酒中OTA污染更为严重，Rem iro等在99%的样品中都检测出了OTA[19]。Ponsone等通过对阿根廷的红葡萄汁、红葡萄酒以及葡萄干中的OTA含量研究，发现葡萄干中污染最为严重，其OTA污染量为0.26～20.28ng/g，远远超过红葡萄汁和红葡萄酒中污染OTA的平均含量——分别为0.12、0.37ng/m L[20]。Quintela等调查发现1995～2008年间里奥哈（Rioja A lavesa）地区的葡萄酒的OTA平均污染量为0.035μg/L，然而在2009年对此地区生产的葡萄酒再次调查时发现，OTA平均含量上升为0.077μg/L[21-22]。Valero等调查了特殊类型的葡萄酒中OTA的污染情况，发现污染的葡萄酒中20%超出了欧盟规定的限量标准（2μg/kg），但是在冰酒、贵腐葡萄酒以及晚收葡萄酒中均没有检出OTA[23]。

与之相比，我国对当地葡萄酒污染OTA的调查相对较少，其中Zhang等在1999～2009年的十年间，对我国大陆主要几个地区的119种葡萄酒（包括干酒、冰酒）取样研究，结果显示OTA污染较为严重，OTA的污染量为＜0.1～5.65μg/L，且东北部地区OTA污染最严重，平均含量为2.18μg/L[24]。我国是一个葡萄酒消费大国，每年都会有大量的进口葡萄酒流入市场，陈杰等分析了宁波进口的84种来自不同地区的葡萄酒中OTA的含量，发现OTA检出率为100%（检测限0.05ng/m L），含量为0.14～1.10ng/m L，如若按照0.2ng/m L的限量标准，则有71.43%的进口葡萄酒中OTA超标[25]。因此在我国，葡萄酒中OTA的污染状况应引起相关监管部门的重视，并需及时制定进口葡萄酒主要污染物风险评估系统及残留限量要求。

2 对OTA产生菌的控制

2.1 葡萄中OTA主要产生菌

青霉和曲霉是葡萄中主要的OTA产生菌，基于目前的研究，炭黑曲霉是其中污染数量最多、产毒量最大的菌种。西班牙学者Belli等连续三年（2001、2002、2003年）对10个果园的不同生长期的不同种类葡萄取样研究，发现黑曲霉是葡萄主要的致病菌，但是只有2%～7%黑曲霉能够产生OTA，而78%～100%炭黑曲霉能够产生OTA，且产毒量大于黑曲霉，Tjamos等在对希腊葡萄园以及葡萄干中的霉菌进行分析时，也得到类似的结论[26-27]。同样，Leong等研究了澳大利亚葡萄的污染状况，在分离到的800多株霉菌中，黑曲霉占大多数，但产毒菌株均为炭黑曲霉[28]。Cabanes等在分析引起白葡萄酒污染的致病菌时，发现其中的产毒菌也只有炭黑曲霉[29]。在我国，何云龙等从烟台赤霞珠中分离到了3株炭黑曲霉，其都能在玉米颗粒培养基上产OTA，但是在葡萄上不产OTA[30]；随后蒋春美等分析了葡萄中分离到的189株霉菌，发现青霉和曲霉的污染率最高，且产毒率分别为9.8%和27%[31]。

2.2 控制OTA产毒菌的生长及产毒

霉菌在葡萄上产生OTA，不仅与葡萄的生长期密切相关，而且与菌株以外其他因素密切相关，如降雨量、温度、土质、风量等。然而这些因素并不是独立的，它们之间相互影响又会产生更多不同的效果。同时因为OTA是霉菌的次级代谢产物，所以霉菌生长最适温度、湿度并不等于最大产毒量的温度、湿度，这又为实际研究增加了难度[32]。总之，获得葡萄园中的产毒菌株，尤其是炭黑曲霉菌株，并结合当地葡萄的生长环境，才能针对性的研究并控制葡萄及其制品中的OTA含量。

不同的OTA产毒菌，生长的条件和产毒条件是不同的，青霉一般适宜生长在温度低于30℃，水分活度低于0.8的环境下；赭曲霉适宜在温和的温度，且水分活度高于0.8的环境中生长；而葡萄中最易污染的炭黑曲霉、黑曲霉，分别适宜在30℃左右的温度下生长，且容易感染成熟果实[33]。刘彬发现赭曲霉菌在葡萄干生长的最适温度为15～25℃，当温度高于30℃和低于2℃时其生长和OTA的产生都停滞；温度为3～10℃时，赭曲霉菌生长缓慢，OTA产生水平也明显降低；同时，赭曲霉菌的生长受环境湿度影响显著，当湿度低于14%时几乎观察不到任何生长[34]。Clouvel等研究了葡萄在日均气温17.2～22.8℃范围内OTA产生情况，发现当温度低于15℃时，真菌的生长被明显抑制，OTA的产生也得到有效的控制[35]。Quintela等发现少雨且高温地区的葡萄更容易污染OTA[21]。

葡萄制品的制作工艺对OTA也会产生影响，Valero等发现通过日晒干燥处理制作出来的葡萄干比其他干燥方式更容易感染OTA；而且，在阴凉干燥的条件下酿造的葡萄酒OTA含量要明显高于干热条件下酿造的葡萄酒，可能因为前者需要干燥时间太长（2～6个月）而极易滋生霉菌，从而导致了OTA的产生[23]。

此外，在葡萄成熟的前期、后期，尤其是在葡萄收获前的20d（可以通过葡萄的含糖量来判断）以及过熟的葡萄上，炭黑曲霉最易侵染葡萄而产生OTA，因此，在葡萄成熟期一直到葡萄收获、运输整个过程都应引起人们的重视[35-37]。

3 葡萄及其制品中OTA的清除

3.1 物理方法

橡木塞是葡萄酒酿造过程中必备的物质，Savino等发现其能去除红葡萄酒中的OTA，而且橡木粉末效果最好[38]。研究表明，葡萄酒酿造过程中使用的许多下胶材料也能够有效吸附葡萄酒中的OTA，其中活性炭在红葡萄酒中的吸附率可达到44.2%～100%，当其剂量为0.24g/L时，去除OTA效果最好；酪酸钾也能达到85%，与之相比，膨润土仅能吸附11.1%～23.7%的OTA；但是在白葡萄酒中，相对其他澄清剂，膨润土具有较好的吸附效果[39-41]。此外，Solfrizzo等发现使用没有污染OTA的葡萄渣，与含有OTA的葡萄酒混合处理24h后，除去葡萄渣，能够清除50%～65%的OTA，而且选用与葡萄酒种类相同的葡萄渣进行处理，更能够很好的保持葡萄酒的色泽以及营养价值[42]。

辐照是一种简单、易操作的方法，迟蕾等研究发现60Coγ射线辐照水溶液的OTA，在4kGy的辐照剂量下，OTA降解率达到90%[43]，但对于能否降解葡萄及其制品中的OTA还需进一步的研究。

3.2 化学方法

化学方法因其具有的高效性，已经普遍应用于实践中，如多菌灵（Carbendazi）和咯菌腈（Fludioxonil）已用于抑制葡萄园中多种霉菌的生长。有研究发现，多菌灵、嘧菌酯（Azoxystrobin）、敌螨普（Dinocap）与硫磺的结合处理还能有效的降低葡萄酒中OTA的含量[27，44]。Belli等发现在转色期以及成熟前21d，混合使用37.5%的嘧菌环胺（Cyprodinil）和25%咯菌腈，对葡萄中的黑曲霉抑制效果最好[45]。然而，Medina等发现多菌灵虽然能抑制多种霉菌，但是对炭黑曲霉的抑制作用很小，而且会增强炭黑曲霉产生OTA，这再次引起了人们对化学杀菌剂的质疑[44]。总之，化学杀菌剂在应用上的安全性应该引起人们的注意，不仅需要严格控制其在规定的限量之内，而且亟需开发一种无毒、无害、环保的化学品，同时还需进一步研究化学杀菌剂是否会产生其他的一些负面效果。

3.3 生物学方法

3.3.1 葡萄酒酿造过程OTA的降解 国外许多学者对葡萄酒酿造过程中OTA的变化情况进行了研究，证明这一过程对降解OTA起了重要的作用。由于地域环境以及葡萄品种的差异，使得研究结果也略有差别。其中Cecchini等研究发现白酒在发酵过程中，OTA会有46.83%～52.16%的降解，而OTA在红酒中的降解率为53.21%～70.13%[46]；Ponsone等模拟了葡萄酒的发酵过程，发现这期间有86.5%的OTA降解；Lasram等也发现红酒在罐装储存过程中会有55%的OTA降解[47-48]；Fernandes等在研究了葡萄牙绿酒（Vinho Verde）在酒精发酵过程中OTA的变化时发现，经过苹果酸乳酸发酵后，OTA残留量仅为8%，而且酒渣里面的OTA含量比酒体溶液初始OTA的浓度高，因此推测可能是在去除发酵沉淀物的过程中去除了部分OTA[49]；Anli等研究了葡萄酒经过后发酵OTA含量的变化，发现6个月的短期陈酿对OTA含量基本没有影响，至少需经过18个月的陈酿，OTA降解率才达到最大，约为17.6%[50]。总之，陈酿还不能完全去除OTA，部分葡萄制品中OTA含量还是超标的，而且，陈酿过程中多数OTA大部分是因为吸附作用残存在固体果渣和生物体中，对环境、人类仍然存在潜在的危害，因此还需要其他措施加以清除。

3.3.2 微生物降解 生物降解OTA是一种相对安全、环保的方法，成为替代化学品的最佳选择，目前被认为是最具有前景的方法。近年来，生物降解OTA逐渐引起人们的重视，国内外大量文献报道了微生物在水溶液中去除OTA的能力。有研究发现，部分酿酒酵母对OTA也有降解作用，这就为其降解葡萄酒中的OTA提供了便利，使得可行性更高[51]。普鲁兰类酵母不仅能够控制有效的抑制炭黑曲霉在葡萄上的生长，同时能够降解OTA[52]。Caridi等研究了20种酵母对葡萄酒中OTA的降解效果，在25℃下经过90d的发酵后，葡萄酒中OTA的降解率为39.9%～92.1%，而发酵残渣里面的含有较高量的OTA，由此推断可能是酵母细胞壁的生甘露糖蛋白对OTA的吸附作用；并通过对比两株酿酒酵母和它们的46个子代酵母对OTA的吸附作用的大小，发现实验所用酿酒酵母对OTA的吸附作用是由基因控制的，因此是一种可遗传的性状，但是子代对OTA的吸附作用表现出了较大的差异[53-54]。Bejaoui等发现实验所用的40株黑曲霉对OTA都有降解作用，并在研究了黑曲霉的分生孢子对OTA的吸附作用中，发现部分黑曲霉表现出了高效的去除OTA的能力，且热杀死的分生孢子仍然具有去除OTA的作用[55-56]。Turbic等发现两株乳酸菌L.rhamnosus GG和L.rhamnosus LC-705，1h就能分别降解47.12%和36.43%的OTA，同时这个过程中咖啡因、维生素B-12和叶酸等降解的很少[57]。

然而，细胞的活性并不一定是去除OTA的重要因素，Mateo等从酒中分离出几株酒类酒球菌（Oenococcus oeni），将其死细胞和活细胞分别培养在含有OTA的培养基中，14d后OTA降解率均超过60%；Bejaoui等发现热杀死的黑曲霉分生孢子仍然具有去除OTA的作用；Var等甚至发现热杀死的酵母细胞细胞表现出了更高的吸附OTA的能力[58-59]。

4 结论

综观目前的研究发现，OTA在葡萄及其制品中的出现极为普遍。然而在我国，对OTA污染状况调查相对较少，同时，葡萄及其制品还没有相应的OTA限量标准，因此亟需建立相关的风险监控体系。此外，为了尽可能减少OTA对人类的危害及环境的污染，还需进一步的研究降解OTA的方法。随着人们对食品安全意识的提高，化学方法处理的食品引起人们的高度警惕，而生物方法结合适当的物理方法去除OTA，克服了化学法带来的安全隐患问题，因此开发一种高效、安全、环保的生物制剂降解OTA具有广阔的应用前景。

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