凡纳滨对虾虾头自溶产物中肽组分的分离及其呈味性能初步研究

伍 彬，章超桦，吉宏武，曹文红，刘 亚，朱国萍

（广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

凡纳滨对虾（Penaeus vannamei Boone），又名南美白对虾。原产于美洲太平洋沿岸水域，我国以广东、福建、浙江及海南为其主要产地，壳薄体肥，含肉率高，肉质鲜美，营养丰富。其产品以去头冻虾为主，导致在加工过程中产生占虾体重30%左右的虾头等下脚料，大部分工厂因未加利用而废弃。虾头中含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、虾红素等营养物质，同时含有各种氨基酸及人体必需的微量元素等[1-2]。蛋白质在降解过程中除了产生游离氨基酸以外，还会产生不同分子量大小的肽段，短肽常具有不同的味感，包括甜味肽，苦味肽，咸味肽，还有鲜味肽等[3-5]。关于肽分离纯化的方法，一般有盐析法、超滤法[6]、离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱等[7]。超滤法很难确定主要的呈味组分，而离子交换，凝胶过滤等其他方法又存在上样量小，流速慢，耗时等问题。大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的高分子吸附剂，具有与活性炭相似的吸附性能，且理化性质稳定，因此被广泛应用于食品领域，如分离制备高F值寡肽、血压肽等[8-10]。本文采用超滤与大孔吸附树脂洗脱相结合的方法，对凡纳滨对虾虾头自溶产物中的短肽进行分离纯化，并结合感官评价，初步确定了自溶产物中短肽的呈味特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凡纳滨对虾虾头 广东湛江国联水产有限公司提供；马尿酰组氨酰亮氨基酸（MW 423U）日本Peptide Institute；标准多肽混合物（含有Triosephosphateisomerase（MW 26625U），Myoglobin（MW 16950U），Aprotinin（MW 6512U），Insulin-B（MW 3496U），Bacitracin（MW 1423U） 美国Biorad公司；AB-8大孔吸附树脂、NKA-Ⅱ大孔吸附树脂 天津兴南允能高分子技术有限公司；XAD-1600、XAD16、MD130、X-5大孔吸附树脂 上海速摩化工原料有限公司；Z型玻璃层析柱（1.6mmx60mm） 上海精科实业有限公司。

UV-2501PC紫外-可见光分光光度计 上海尤尼科仪器厂；Waters 600E高效液相色谱仪 美国waters公司；N-2000液相色谱工作站、QT-智能紫外检测器、TH-1000A梯度混合器、DBS-100-LCD电脑全自动部分收集器 上海琪特分析仪器有限公司；超滤机Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虾头自溶产物的制备 将虾头在高速组织匀浆器中匀浆，匀浆后置于烧杯中，按料液比1∶3加水搅拌混匀，调节pH至7.85，置于50℃水浴锅中保温自溶反应3h，后于100℃水浴灭酶10m in，冷却，5000r/m in离心15min，取上清液，即为样品溶液[11]。

1.2.2 自溶产物的超滤 将自溶产物分别用截留量为8000、5000、1000u超滤膜超滤（Am icon model 8200，M illipore Corporation），分离的条件：压力0.25MPa，温度4℃。

1.2.3 超滤组分肽基态氮含量的测定 分别采用凯氏定氮法[12]和甲醛滴定法[12]测定，肽基态氮含量=总氮量-总氨基态氮量。

1.2.4 超滤组分的感官评价 方法参考文献[13]，感官评价小组成员由受过感官培训（经三点检验试验合格者确定为品评员）的5名女生，5名男生组成（年龄在20～30岁之间）。选用谷氨酸钠、蔗糖、食盐、硫酸奎宁和柠檬酸分别作为鲜味、甜味、咸味、苦味和酸味五种风味的标准物质。五种基本呈味标准物质配制成不同的浓度，品尝鉴定。在室温条件进行评定，将样品配成固形物为2%的溶液，取20m L盛放在杯中，评品员依次从低浓度开始品尝标准味感物质后，用小勺将溶液含在口中停留15s（勿咽下）活动口腔，使样品溶液接触整个舌头，仔细辨别味道，然后吐出样液，每次品尝完后用清水漱口，需等待1m in，再品尝。最后品尝样液，然后根据五种标准味感物质给出相应的分数（五分制）。评分标准：5—非常强，4—强，3—标准，2—弱，1—很弱，0—不可鉴别。

1.2.5 超滤组分的HPSEC分析 采用高效体积排阻色谱（HPSEC）法测定超滤组分的分子量分布，流动相为50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）。将分子量标准品配制成水溶液，上样10μL至Waters-PROTEINPAK60柱进行高效液相色谱洗脱，流动相流速0.7m L/m in，监测214nm处的吸光值，建立分子量M的对数与洗脱保留时间t之间的回归方程。将自溶产物经过针式过滤头（0.45μm）过滤后在相同的条件下进行高效液相色谱洗脱，利用分子量回归方程考察酶解产物的分子量分布。

1.2.6 超滤组分的大孔吸附树脂的分离纯化

1.2.6.1 大孔吸附树脂型号的选择 大孔吸附树脂的预处理：用95%醇浸泡24h，过滤后用大量蒸馏水洗至澄清、无醇味，然后用2～3倍体积1%盐酸浸泡3～5h，浸泡过程不断搅拌。用蒸馏水充分洗树脂至中性后再用2倍体积1%NaOH浸泡处理，最后用蒸馏水洗至中性并去除悬浮物，备用。

大孔吸附树脂的静态吸附与解吸实验：静态吸附实验：于250m L具塞锥形瓶中加入5.0g处理好的干树脂，用无水乙醇充分溶胀，再用去离子水洗净乙醇，吸干水分。加入50m L经感官实验得出最好的的超滤组分（蛋白浓度为12.86mg/m L），塞好塞子，将该锥形瓶放入25℃水浴恒温振荡器中振荡24h（振荡速度为160r/min），使树脂与料液充分接触；振荡结束后，滤纸过滤，将树脂与溶液分离；测定溶液中的蛋白质含量。按以下公式计算[14]：

其中：解吸液浓度，mg/m L；解吸液体积，m L；吸附液浓度，mg/m L；吸附液体积，m L。

1.2.6.2 大孔吸附树脂对呈味肽的分离 用已选好型号且经预处理好的大孔吸附树脂装填1.6×60cm的层析柱，在室温条件下将经感官评价确定的最优的超滤液上柱，用紫外检测器检测流出液的A220nm，以A220nm=0.05为透过点。用10%、30%、50%、70%和90%乙醇分别洗脱树脂，流速为1.0m L/m in。收集洗脱峰，减压浓缩除去乙醇，再将溶液冷冻干燥用于分析。

1.2.7 氨基酸组成分析 样品经处理后，采用氨基酸自动分析仪测定，参照GB/T14965-1994，将样品液碱解后上氨基酸自动分析仪。测定条件：No.2619离子交换柱（26×150mm），柱温53℃，泵流速0.225m L/m in，泵压8.8MPa，分析时间72m in，进样量50μL。

1.2.8 数据分析 实验数据均实验三次取平均值。

2 结果与分析

2.1 自溶产物的超滤

虾头自溶产物经将截留量为8000、5000、1000u超滤膜超滤，分离出四种超滤组分：8000u以上；8000～5000u；5000～1000u；1000u以下。各个组分中5000～1000u组分肽态氮的含量最高，达12.86mg/m L，其次是1000u组分，为10.01mg/m L，其含量最少的是8000u以上组分。这说明，虾头中的蛋白质在自身酶系的作用下，降解为一系列分子量大小不同的肽段，而且这些肽短的分子量主要集中在5000u以下。

2.2 超滤组分的感官评价

由图1知，分子截留量在5000u以上，以苦味为主，5000u以下，以鲜味和甜味为主。再分析各超滤组分的呈味特点：8000u以上组分，最突出的味感是苦味，其次再是鲜味和甜味；8000～5000u组分，最突出的味感也是苦味，其次再是鲜味和甜味；5000～1000u组分中，最突出的味感是鲜味和甜味，苦味很弱；1000u以下组分，突出的味感是鲜味和甜味，还有是咸味。由2.1可知，5000～1000u组分肽基态氮含量最高，因此5000～1000u组分选取作为进一步分离纯化的目标。

图1 超滤组分的风味轮廓图Fig.1 Flavor outline drawing of ultrafiltration components

2.3 超滤组分的HPSEC分析

图2为6种分子量标准多肽（Triosephosphateisomerase、Myoglobin、Aprotinin、Insulin-B、Bacitracin和HHL）的HPSEC图，将分子量标准物质的保留时间t和分子量的对数LgM在平面坐标系中描点，得到分子量回归方程为LgM=-0.2177t+6.2791，相关系数R= 0.9868，说明两者线性相关性及回归性良好。

图2 分子量标准的HPSEC图谱Fig.2 HPSECmapping ofmolecular weight standard

采用HPSEC研究了5000～1000u超滤组分的分子量分布情况，结果见图3。计算出5000～1000u超滤组分分子量分布情况（表1）。在5000～1000u超滤组分中，分子量5000u以下的组分比重达到82.07%，而且主要是集中在3000～1000u，占了50.80%；1000u以下达26.23%，跟超滤分离是粗分离有较大关系，小肽有可能通过氢键结合为较大的分子，被截留在了5000～1000u之间。结合2.2感官实验，推断出呈鲜味和甜味的肽分子量主要集中在3000～1000u，与宋美等[15]研究大豆蛋白呈鲜组分所得到的结果类似。

图3 5000～1000u超滤液Fig.3 Ultrafiltrate between 5000～1000u

表1 5000～1000u超滤组分分子量分布（%）Table1 Molecularweight distribution of the 5000～1000u（%）

2.4 超滤组分的大孔吸附树脂分离纯化

2.4.1 大孔吸附树脂型号的选择 六种大孔吸附树脂对5000～1000U组分的吸附量和解吸率见图4，可以得出XAD-16这种型号的大孔吸附树脂效果最好，吸附量84.95mg/g，解吸率为56.99%。

图4 六种树脂的吸附量与解吸率Fig.4 Absorption capacity and desorption rate of 6 resins

另外，大孔吸附树脂是一种表面吸附剂，其吸附力强弱与树脂的比表面积、表面电性及能否与被吸附物质形成氢键和疏水相互作用等有关。通常认为比表面积决定吸附剂的饱和吸附量，而平均孔径和极性决定吸附剂的吸附速率[16]。由图4知，XAD-16树脂的比表面积最大，且在分离生物活性物质时，具有可逆性，解吸率也高，因此，本研究选择该树脂进行吸附动力学实验。

2.4.2 大孔吸附树脂分离条件的确定

2.4.2.1 洗脱剂的选择 一般可以用溶剂的溶解度参数来预测，溶解度参数越小的溶剂解吸效率越高。常见溶剂水、甲醇、乙醇和丙酮的溶解度参数分别为23.2、14.5、12.7和10.0[17]。还考虑到在大孔吸附树脂分离后，还要品评其分离出的组分，因此本实验中采用乙醇-水溶液作为解吸剂。

2.4.2.2 上样浓度的确定 将5000～1000u收集液真空冷冻成干粉，然后取一定的干粉分别配制成0.5、1.0、2.0mg/m L水溶液上样，用乙醇-水作为洗脱液，以确定其最佳上样浓度。从图5可以看出，不同上样浓度，其泄漏体积是不一样的，当样品浓度为0.5mg/m L时，肽的泄漏体积为50m L，而且收集的洗脱液中肽含量也是最高的。这是因为浓度低时，样品能够和树脂充分接触，在疏水相互作用下，充分吸附到树脂上，从而和高浓度条件下相比，损失率较低，结果确定以0.5mg/m L为最佳样品浓度。

图5 不同样品浓度的洗脱曲线Fig.5 Eluting curve of difference sample concentration

2.4.2.3 流速的确定 根据2.4.2.2确定的上样浓度上样，然后分别将恒流泵的流速设定为0.5、1.0、2.0mg/min、以确定最佳流速。由图6可知，随着流速的增加，小肽回收率降低。这是因为流速增加，减少了洗脱剂与树脂接触的时间，疏水性肽不能被完全置换下来。但是0.5mg/m in和1.0mg/m in相比，小肽回收率相差不大，但进一步提高流速到达2.0mg/m in，小肽回收率下降比较显著。考虑到生产中希望尽量缩短周期并保证较高回收率，选择1.0mg/m in为最佳流速。

图6 不同上样流速的洗脱曲线Fig.6 Eluting curve of difference sample speeds

2.4.2.4 分级洗脱 装好层析柱，将5000～1000u组分，按前两节所确定的上样浓度（0.5mg/m L），和流速（1.0mg/m in）上样。为了分离出呈味的组分，本实验采用改变洗脱液的极性，来达到分离的目的，因此，依次采用10%、30%、50%、70%和90%的乙醇作为洗脱剂，对呈味肽进行分级洗脱。分别收集各个组分，并测其肽态氮含量（见图7）。从图7还可以看出，大部分小肽在乙醇浓度10%和30%下被洗脱，而且随着乙醇浓度增大，被洗脱出来的组分的肽态氮含量逐步下降。洗脱后，收集到五种洗脱组分，分别是X 10%（表示用10%乙醇洗脱出来的组分，下同）、X30%、X50%、X70%和X90%，再通过减压蒸馏除去各个组分中的乙醇，冷冻干燥，进行感官品评，并对其感官评分最好的分析其结构氨基酸。

图7 洗脱组分的肽态氮含量Fig.7 Contentof peptide nitrogen in elution fractions

2.4.2.5 各洗脱组分的感官评价 经感官品价，各洗脱组分的呈味特点的结果如图8所示，五种洗脱组分主要的呈味特点都是鲜味和甜味突出，其中味道最佳的是X30%洗脱组分，其次是X90%组分。进一步分析X30%洗脱组分中的结构氨基酸。

图8 各洗脱组分的感官评价Fig.8 Sensory evaluation of elution fractions

2.4.2.6 X30%洗脱组分的氨基酸构成 凡纳滨对虾虾头酶解液中的氨基酸组成如表2所示，洗脱组分中Asp、Glu、Gly、Ala、Pro等呈鲜味和呈甘味的氨基酸总含量达35.71g/100g，占总游离氨基酸的36.11%，尤其是谷氨酸、脯氨酸含量较高，分别达15.29、11.89g/100g，这也正好印证了2.4.2.5中30%乙醇洗脱组分的感官得分最高。

3 结论

虾头自溶产物经三种超滤膜超滤，发现5000～1000u组分肽态氮的含量最高，达12.86mg/m L。且该组分味道最为鲜美，且经HPSEC分析，发现其分子量主要分布3000～1000u之间。选取XAD-16大孔吸附树脂作为分离用树脂，确定了最佳的分离条件为：洗脱液，乙醇-水混合溶液；最佳上样浓度：0.5mg/m L；最佳上样流速：1.0mg/min。采用大孔吸附树脂在最优条件下分离呈味肽，用30%乙醇洗脱出来的组分感官评价最好，其呈鲜味和呈甘味的氨基酸总含量达35.71g/100g，占氨基酸总量的36.11%。

[1]张祥刚，周爱梅，林晓霞，等.凡钠滨对虾虾头、虾壳化学成分的对比研究[J].现代食品科技，2009，25（3）：224-227.

表2 X30%洗脱组分中结构氨基酸含量Table2 Contents of amino acids in autolysates of

[2]彭燕，曾霞.凡钠滨对虾虾头的营养成分分析及评价[J].茂名学院学报，2002，17（1）：25-27.

[3]张梅秀，王锡昌，刘源.食品中的呈味肽及其呈味机理研究进展[J].食品科学，2012，33（7）：320-326.

[4]李莹，黄开红，周剑忠，等.水产蛋白酶解制备鲜味肽[J].食品科学，2012，33（13）：248-253.

[5]乔路，佟伟刚，周大勇，等.酶法制备鲍鱼脏器呈味肽及呈味氨基酸[J].大连工业大学学报，2011，30（3）：168-174.

[6]赵谋明，肖如武，崔春，等.超滤对马氏珍珠贝肉蛋白酶解液特性的影响[J].华南理工大学学报，2009，37（10）：124-129.

[7]赵锐，顾谦群，管华诗.多肽物质分离与分析方法研究进展[J].中国海洋药物，2000（3）：8-53.

[8]林流丹，欧仕益，吴建中，等.采用大孔树脂从罗非鱼酶解物中分离低聚肽的研究[J].食品科技，2008（8）：168-172.

[9]黄艳春.酶解淡水鱼蛋白制取血管紧张素转化酶抑制肽的研究[D].武汉：华中农业大学，2004.

[10]林莉.玉米蛋白酶解制备高F值低聚肽及应用研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2003.

[11]CaoW H，Zhang C H，Hong P Z，et al.Response surface methodology for autolysis parameters optimization of shrimp head and amino acids released during autolysis[J].Food Chemistry，2008，109（1）：176-183.

[12]张水华.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社出版，2007：240-244.

[13]张水华.食品感官分析与实验[M].北京：化学工业出版社，2006：86-90.

[14]程云辉，王璋，许时婴.大孔吸附树脂对麦胚肽的吸附特性研究[J].食品与机械，2005，21（6）：7-12.

[15]宋美，郭顺堂.大豆蛋白呈鲜组分的制备及其性质研究[J].大豆科学，2006，25（4）：349-354.

[16]邓劲光，胡熙恩，朱永.大孔吸附树脂对氢化可的松的吸附与洗脱性能研究[J].离子交换与吸附,2000,16（2）：134-139.

[17]焦连庆，魏俊杰，徐景达.红参须根中多肽成分的分离与鉴定[J].中草药，1996，27（2）：70-72.