不同处理方式对紫菜多酚清除氧自由基的影响

李颖畅，王亚丽，刘明爽，马春颖，张丽华，励建荣

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013；2.辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013；3.辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013）

活性氧自由基，例如羟自由基、超氧阴离子影响细胞膜的流动性，使蛋白质多肽链发生断裂，脂质过氧化、DNA氧化，从而会引起一些慢性疾病，例如癌症、炎症、高血脂和动脉硬化等[1]。多酚具有抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病作用，对这些疾病的预防与治疗很多是源于多酚的抗氧化活性[2-4]。近年来，由于多酚广泛的生物活性，引起了人们的热切关注。紫菜是红藻门（Rhodophyta）原红藻纲（Protoflorideophy-ceae）红毛菜目（Bangiales）红毛菜科（Bangiaceae）紫菜属（Porphyra）的统称[5]。在我国紫菜是食用较普遍的海藻之一，具有丰富的营养，是理想的高蛋白低脂肪的健康食品。研究表明，紫菜的蛋白质含量为20%～35%，与大豆蛋白含量相似。紫菜富含有8种人体必需的氨基酸，并且不饱和脂肪酸的含量较高，可以有效预防心血管疾病[6-8]。紫菜中维生素的含量也比较丰富，主要含有B族维生素、维生素C、维生素E、胡萝卜素等[9]。同时，紫菜由于生长在化学组分极为复杂的海水中，还蕴含极为丰富的无机成分，是重要的矿物质来源[10]，同时紫菜中多糖、多酚含量也非常丰富[8]。钟明杰和王阳光[11]采用微波技术对紫菜多酚进行了提取并研究对DPPH自由基的清除能力和还原力。赵国玲等[12]研究了坛紫菜不同溶剂组分的抗氧化活性。关于一些理化因素对紫菜多酚提取物抗氧化活性的影响还未见报道，同时羟基自由基是对人体健康危害最大的自由基[13]，本文研究了温度、光照、微波pH对紫菜多酚提取物清除羟基自由基的影响，这对紫菜多酚充分应用于食品的加工与贮藏中具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫菜 大连辽海食品贸易有限公司；水杨酸、硫酸亚铁、无水乙醇、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、柠檬酸、柠檬酸钠 分析纯，天津市光复精细化工研究所；盐酸、邻苯三酚（焦性没食子酸） 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；AB-8大孔树脂 天津海光化工有限公司。

RRH-100型万能高速粉碎机 欧凯莱芙（香港）实业公司；FA2410型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；UV-2550型紫外-可见分光光度计日本岛津；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-III型循环水真空泵 郑州长城科工贸有限公司；pHS-25型酸度计 上海理达仪器厂；柱层析装置 上海青浦沪西仪器厂；DHG-9038型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；真空冷冻干燥机 THERMO；HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫菜多酚提取物的制备 根据文献[14]，略作修改。将紫菜50℃烘干，粉碎后过40目筛。称取20g紫菜粉末，按1∶30（g/m L）的料液比加入59%的乙醇溶液，超声波辅助提取紫菜多酚，超声功率468W，超声时间13m in，提取后过滤，收集滤液，用旋转蒸发仪50℃浓缩，AB-8大孔树脂纯化，浓缩洗脱液，冷冻干燥机干燥，得到浅红色粉末。

1.2.2 Folin-Ciocalteu法[15]测定多酚含量 精确称取25mg没食子酸标准品，用蒸馏水定容到1000m L，配制成25μg/m L的标准溶液。分别准确量取1m L没食子酸标准液和1m L样品溶液于25m L容量瓶中，加入1m L Folin-Ciocalteu试剂，0.5～8min内加入3m L 10%Na2CO3溶液，混匀后定容，在30℃下避光放置1.5h，在330～ 1100nm波长范围内进行扫描，以确定最佳吸收波长。精确吸取0、1、2、3、4、5、6m L上述标准溶液于25m L容量瓶中，按照上述操作进行实验，在最佳波长下测定吸光值，并绘制标准曲线。

通过波长扫描确定最大吸收波长为750nm，以没食子酸浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线，回归方程为y=0.1039x+0.008，R2=0.9990，吸光度与浓度具有良好的线性关系。通过标准曲线方程计算紫菜多酚含量，紫菜多酚提取物中多酚含量为73.17%，后续实验紫菜多酚浓度是以实际多酚含量进行计算的。

1.2.3 清除羟基自由基（·OH）能力的测定[16]利用H2O2与Fe2+反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm波长处有最大吸收。在反应体系中加入1m L 10mmol/L的FeSO4溶液，1m L 10mmol/L水杨酸溶液（溶剂为乙醇）后，分别量取不同浓度紫菜多酚提取物各1m L，最后加入1m L 8.8mmol/L H2O2溶液启动反应，37℃反应30m in，在510nm波长处测定各浓度的吸光度。

式中：A0为用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液代替样品的吸光度；Ai为加入样品溶液的吸光度；Aj为不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。

1.2.4 紫菜多酚浓度的选择 将紫菜多酚配制成浓度为100、200、300、400、500、600μg/m L的溶液，并按上述方法测定其对羟基自由基清除能力，然后按清除率公式分别计算其对羟自由基的清除率，当清除率达到一定值后并开始处于稳定状态，此时紫菜多酚浓度为最适宜的浓度。

1.2.5 不同处理方式对紫菜多酚清除羟基自由基的影响

1.2.5.1 温度对紫菜多酚清除羟基自由基的影响 量取500μg/m L紫菜多酚溶液100m L于锥形瓶中，盖紧塞子，分别用30、60、90℃水浴中加热5h，每隔1.0h取出锥形瓶，立即用自来水冷却，测定紫菜多酚对羟基自由基的清除率。

1.2.5.2 光照对紫菜多酚清除羟基自由基的影响 量取500μg/m L紫菜多酚溶液100m L于锥形瓶中，盖紧塞子，分别置于自然光光照和避光，每隔一段时间（0、2、5、10、15、25d）取样测定对羟基自由基清除率。

1.2.5.3 微波对紫菜多酚清除羟自由基的影响 量取500μg/m L紫菜多酚溶液100m L于锥形瓶中，盖紧塞子，用微波处理，微波功率为600W，测定不同微波处理时间（0、2、5、10、15、20、25、30m in）对羟基自由基清除率。

1.2.5.4 pH对紫菜多酚清除羟自由基的影响 将紫菜多酚浓缩液用不同pH的缓冲溶液稀释，测定在不同pH条件下（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）对羟基自由基的清除率。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析，p＜0.05为差异显著，实验数据用表示。

2 结果与分析

2.1 紫菜多酚浓度对清除羟基自由基的影响

从图1可以看出，在一定浓度范围内，随着紫菜多酚浓度的增加，多酚对羟自由基清除率提高。紫菜多酚浓度超过500μg/m L后，清除率增长缓慢，当紫菜多酚浓度为500μg/m L与600μg/m L时，清除率无显著性差异（p＞0.05）。因此，选择500μg/m L的紫菜多酚溶液作为以下实验的最适宜溶液。

图1 紫菜多酚浓度对清除羟自由基的影响Fig.1 The effectof concentration of polypenols from Porphyra dentate on scavenging hydroxyl free radical

2.2 温度对紫菜多酚清除羟基自由基的影响

从图2可以看出，不同温度对紫菜多酚提取物清除羟自由基能力的影响不同。在30℃时，随着时间的延长，紫菜多酚对羟自由基的清除率无显著变化。60℃时，在最初1h，对羟基自由基的清除率显著降低（p＜0.05），以后清除率变化趋于平缓。90℃对紫菜多酚清除羟自由基有显著影响，随时间的延长，清除率呈下降趋势。可能是高温导致紫菜多酚部分降解，紫菜多酚对羟基自由基的清除能力下降。Kaiser等[17]研究发现热处理使部分多酚含量降低，影响多酚稳定性，这和我们研究结果是一致的。可见在60℃以内，紫菜多酚保存比较好，紫菜多酚对羟基自由基清除能力相对较高。

图2 温度对紫菜多酚清除羟自由基的影响Fig.2 The effectof temperature on scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

2.3 光照对紫菜多酚清除羟基自由基的影响

从图3可以看出，光照影响紫菜多酚对羟基自由基的清除率。在避光条件下，紫菜多酚对羟基自由基的清除率随着时间的延长而降低；10d之内，对羟基自由基清除率降低缓慢，10d之后对羟基自由基清除率降低加速。相对避光条件，自然光光照条件下紫菜多酚对羟自由基清除率降低幅度比较大。放置25d后，自然光光照和避光条件下，紫菜多酚对羟基自由基的清除率分别为39.73%和50.64%。说明紫菜多酚在避光条件下相对比较稳定，清除羟自由基能力比较强。

图3 光照对紫菜多酚清除羟自由基的影响Fig.3 The effectof lighton scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

2.4 微波对紫菜多酚清除羟自由基的影响

从图4可以看出，在微波处理5m in之内，紫菜多酚对羟基自由基清除率降低比较少，在10min时，清除率快速降低，之后清除率降低趋于平缓。可能的原因是，微波使一些多酚聚合体降解，多酚清除率提高；同时存在微波对多酚的热效应，使多酚清除率降低，紫菜多酚对羟基自由基清除率的影响是二者综合作用的结果。

图4 微波对紫菜多酚清除羟自由基的影响Fig.4 The effectofmicrowave on scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

2.5 pH对紫菜多酚清除羟自由基的影响

从图5可以看出，pH 3.0～6.0时，紫菜多酚对羟基自由基清除率没有明显变化，pH7.0时，清除率略有降低，但下降不显著，说明紫菜多酚在pH 3.0～7.0比较稳定，对羟基自由基清除能力较高。在pH8.0时，紫菜多酚对羟基自由基清除率显著下降。可见紫菜多酚在酸性条件下抗氧化活性比较稳定，在碱性条件下抗氧化活性不稳定。

3 结论

紫菜多酚对羟基自由基有较强的清除效果，且随紫菜多酚浓度的增加，清除作用增强。加热使紫菜多酚清除羟基自由基能力降低，在60℃以内，紫菜多酚保存比较好，紫菜多酚对羟基自由基清除能力相对较高；温度超过60℃后，随加热时间延长、加热温度升高，对氧自由基清除能力降低的越多。光照方式对清除羟自由基能力降低幅度为自然光光照＞避光，光照时间越长，清除率降低幅度越大。微波影响紫菜多酚对羟基自由基清除率，在10min时，清除率快速降低，之后清除率降低趋于平缓。在pH 3.0～7.0紫菜多酚对羟基自由基清除能力比较稳定。

图5 pH对紫菜多酚清除羟自由基的影响Fig.5 The effect of pH on scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

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