饮料酒中甲醇与杂醇油的气相色谱法分析

黄 贞

（福州市产品质量检验所,福建 福州 350008）

饮料酒中甲醇与杂醇油的气相色谱法分析

黄 贞

（福州市产品质量检验所,福建 福州 350008）

为了提高酒中甲醇、杂醇油测定的精密度和准确度，节省分析时间和分析成本。本实验探索研究采用丙酸乙酯作为用气相色谱法的内标物，测定饮料酒中的甲醇和杂醇油(异丁醇、异戊醇)含量的方法。采用GDX-102不锈钢填充柱进行分离，氢火焰离子化检测器检测，利用保留时间定性，并以丙酸乙酯作内标定量，并顺带测定了其中的乙酸乙酯、正丙醇和正丁醇的含量。得到了令人满意的结果：方法的准确度高，7种组分的加标回收率在90.1%～108.8%之间；方法的重现性精密度即相对标准偏差在0.00%～5.37%之间，符合国标规定的气相色谱的测定误差不大于10%的要求。

气相色谱；丙酸乙酯；内标法；甲醇；杂醇油

1 引言

我国酒类生产和消费，已有悠久的历史，是古代文明、科学文化成就的重要组成部分，白酒已是人们日常生活中常见的饮料之一。白酒是我国传统的蒸馏酒，又名烧酒，是以粮食为原料，经糖化、发酵、蒸馏而得。在发酵过程中会产生微量甲醇和杂醇油(以异丁醇和异戊醇计) ，甲醇和杂醇油能与有机酸结合生成酯，使酒具有独特的香味，但又有一定的毒性。

外标法是现在测定酒中甲醇、杂醇油的标准方法，目前测定饮料酒成分的实验中绝大多数是用外标法[1]，其操作较为繁琐，重现性差。与外标法比较，内标法具有准确度高，重复性好，不受进样误差对结果的影响等优点[2]。

文章主要目的是研究用气相色谱法，建立一种内标实验方法，快速准确的测量饮料酒中的甲醇和杂醇油含量。并以此法对市面所售饮料酒中甲醇与杂醇油进行检测，以了解目前市售酒的质量状况。

2 材料与方法

2.1 实验材料

实验酒样品来源于超市随机抽样，分别是：绵竹大曲（四川绵竹剑南春酒厂有限公司生产）、红星二锅头（北京红星股份有限公司生产）、老白干（四川省久源酒业有限公司生产）。

2.2 试剂

甲醇、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯、异丁醇、正丁醇、异戊醇（均为色谱纯）；丙酸乙酯（自制色谱纯）。

2.3 主要仪器

仪器：GC-4000A气相色谱仪；氢火焰离子化检测器( FID)；

色谱柱：φ4mm×2m不锈钢填充柱；

固定相: GDX-102 (60～80目)，最高使用温度270℃。

2.4 色谱条件

选用GDX-102不锈钢填充柱，同时考虑柱子使用寿命，使用温度不宜太高[3]，在温度100℃～200℃的范围内，每隔20℃为一个温度梯度，做了5次试验，确定在140℃和160℃时分离较为清楚。在140℃～160℃之间，每隔5℃为一个温度梯度再做三次试验，最终确定145℃时分离度最好，而且分离时间最短。

实验发现气相色谱适宜条件为：柱温145℃；汽化室温度200℃；检测器温度200℃；各种气体流速为：氢气40mL/min，空气450mL/min，氮气40mL/min；进样体积1μL。

2.5 内标物

2.5.1 内标的选择

选做内标必须符合一定的条件，即：①在待测样品中不得含有该种成分；②其保留时间与待测组分相近，但能完全分离；③化学结构与待测组分相似； ④不与待测组分发生任何化学反应[4]。

对单纯酒样直接进样1µL，在上述色谱条件下的色谱图如图1，从图上可以看出，在7.5min～12.5min这段时间内，在该色谱柱上没有色谱峰出现。对多种白酒进行直接进样同样发现在该时间段内出峰为空白。若能在该时间段内选择一种可以出峰的物质，即可以满足对内标的要求。

图1 空白酒样色谱图

2.5.2 内标的确定

经过对五十多种实验室已有的液体和固体物质进行进样实验，结果都不乐观，没有可以满足要求的试剂，最终决定自制酯类物质（因为酯类物质与待测物质的性质相似）。在合成的乙酸正丁酯、乙酸正戊酯、丙酸丁酯和丁酸乙酯中最终确定丙酸乙酯为该试验的内标物[5]，其保留时间为10.41min，正好落在样品空白的范围内。丙酸乙酯为无色液体，有菠萝香味，沸点为99.1℃，与乙醇、乙醚混溶，微溶于水。可以与酒样互溶，满足内标要求。

2.5.3 丙酸乙酯（Ethyl propionate）的制备

2.5.3.1 试剂

丙酸、无水乙醇、浓硫酸，无水碳酸钠、无水硫酸钠（均为分析纯）、去离子水。

2.5.3.2 主要仪器

真空蒸馏装置包括：旋转蒸发器（EYELA ROTARY EVAPORATOR N-1001）；SHB循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；水浴加热器（EYELA digital water bath SB-1000）；

气相色谱GC4000A（检测器为：氢火焰检测器、色谱柱为：GDX-102柱）。

2.5.3.3 原理

丙酸和乙醇在浓硫酸作为催化剂的条件下，加热到一定的温度，可以发生酯化反应，生成丙酸乙酯和水[6]。反应方程式如下：

2.5.3.4 步骤

在500mL的反应器中加入25mL的丙酸和25mL的乙醇，用胶头滴管吸取两管浓硫酸，缓慢地滴加到反应器中（浓硫酸放热）。

将水浴加热器温度设定在65℃左右（乙醇的沸点是78.5℃，丙酸的沸点是140.7℃，避免乙醇沸腾），缓慢旋转水浴加热30min。

打开真空装置，收集馏出组分（全部收集）。其组分中含有丙酸乙酯、水及少量的乙醇、丙酸和反应副产物乙醚，转移至烧杯中。

往烧杯中加入20mL的去离子水（乙醇和乙醚均可大量溶于水中），再往烧杯中加入无水碳酸钠，并不断地用洁净的玻璃棒搅拌使其溶解，直到加入的无水碳酸钠不再有二氧化碳气体冒出为止，用pH试纸检验酯层显中性（此时丙酸已经全部被去除）。

将混合液移入分液漏斗中，充分振摇后，静止。弃去下层水溶液，酯层自漏斗上口倒入干燥的100mL锥形瓶中，用无水硫酸钠干燥。将干燥的丙酸乙酯转移到试剂瓶中保存待用。

2.5.3.5 丙酸乙酯的纯度检验

用微量进样器取0.2μL的丙酸乙酯，145℃柱箱温度，在上述2.4的仪器色谱条件下进样检验。结果如图2所示。

图2 丙酸乙酯纯度检验

检验结果：用气相色谱检验， 根据定性试验，保留时间为10.41min的样品为丙酸乙酯。如图2所示，根据分析结果显示，纯度为99.95%，可以作为色谱实验试剂。

3 结果与讨论

3.1 酒样定性实验

气相色谱定性分析就是要确定分析样品中有些什么组分，就是要确定各色谱峰代表什么组分[7]。白酒行业常用的定性方法有两种：一是利用已知物直接对照进行定性，二是利用文献值对照进行定性[8]。该实验采用第一种定性方法将未知物和已知标准物在同一色谱柱上，用相同的色谱操作条件进行分析，作出色谱图后进行对照比较。

进样1μL的纯酒样，在色谱图上的峰图如图1所示 。再根据各个组分的保留时间来定性。如图3所示，甲醇的保留时间为：0.71min；正丙醇的保留时间为：2.84min；乙酸乙酯的保留时间为4.64min；异丁醇的保留时间为5.63min；正丁醇的保留时间为7.29min；丙酸乙酯的保留时间为10.41min；异戊醇的保留时间为14.56min。

根据各个组分的保留时间可以确定在色谱图上的出峰顺序为：1、甲醇；2、乙醇；3、正丙醇；4、乙酸乙酯；5、异丁醇；6、正丁醇；7、丙酸乙酯8、异戊醇。由于实验仪器的不稳定性，在每次实验过程中，保留时间都会有稍微的变化，但是变化的范围不大，所以可以根据样品的出峰顺序确定各个组分。

图3 各组分保留时间

3.2 定量实验

色谱定量分析就是要确定样品中某一组分的准确含量[9]。色谱定量分析与绝大部分的仪器定量分析一样，是一种相对定量方法，而不是绝对定量方法。它是根据仪器检测器在某些条件限定下，色谱峰的峰高或峰面积与所测组分的浓度成正比来进行定量的，其基本公式为：

在色谱定量分析中，要得到可靠的定量分析结果，必须准确测定峰面积或峰高和校正因子，选择合适的定量方法，尽可能减少分析步骤带来的误差[10]。本实验分析采用测量峰面积、用内标法进行定量计算。

3.2.1 标准溶液配置

3.2.1.1 各标准储备溶液

准确称取甲醇3.68g、正丙醇4.02g、异丁醇3.92g、正丁醇3.77g、异丁醇3.12g分别于5个预先盛有20mL去离子水的100mL的容量瓶中，用去离子水定容至刻度，并放置于冰箱中保存。

准确称取乙酸乙酯3.41g和丙酸乙酯3.83g于2个100mL的容量瓶中，用30%的乙醇水溶液（乙酸乙酯和丙酸乙酯在水中的溶解度很小，但在乙醇中的溶解度很大）定容至刻度，并放置于冰箱内保存。

3.2.1.2 混合标准储备液的配置

分别用1mL胖肚移液管准确移取各标准储备溶液1mL于25mL的容量瓶中，用去离子水定容到刻度。此标准储备液中各个组分的浓度分别为：甲醇1.47×10-3g/mL；正丙醇1.61×10-3g/mL；乙酸乙酯1.36×10-3g/mL；异丁醇1.57×10-3g/mL；正丁醇1.51×10-3g/mL；丙酸乙酯1.53×10-3g/mL；异戊醇1.25×10-3g/mL。

3.2.1.3 标准使用液的配置

用2mL移液管准确移取混合标准储备液2mL 于10mL的容量瓶中，用去离子水定容于刻度，此标准使用液中各个组分的浓度分别为：甲醇2.94×10-4g/mL；正丙醇3.22×10-4g/mL；乙酸乙酯2.72×10-4g/mL；异丁醇3.14×10-4g/mL；正丁醇3.02×10-4g/mL；丙酸乙酯3.07×10-4g/mL；异戊醇2.50×10-4g/mL。

3.2.2 相对校正因子（f）的测定

待色谱仪基线稳定后，用微量进样器吸取1μL标准使用液注入仪器中，出现如图4所示的混合加标标准色谱图。出现的色谱峰与保留时间对应的物质分别是：甲醇0.73min、正丙醇2.93min、乙酸乙酯4.82min、异丁醇5.90min、正丁醇7.28min、丙酸乙酯10.88min及异戊醇15.37min，其中丙酸乙酯为内标物。根据内标物峰面积(As) 、内标物浓度(Cs) 、标准物峰面积(Ai) 、标准物浓度(Ci)，相对校正因子公式：分别计算出各组分校正因子为：甲醇(f甲醇=0.992)、正丙醇(f正丙醇=0.795)、乙酸乙酯(f乙酸乙酯=1.168)、异丁醇(f异丁醇=0.771)、正丁醇(f正丁醇=0.804)、丙酸乙酯（f丙酸乙酯=1.000）和异戊醇(f异戊醇=0.752)。

图4 加标标准色谱图

3.2.2.1 相对校正因子计算举例

3.2.3 酒样组分浓度测定

3.2.3.1 加内标酒样的配置

取0.2mL的丙酸乙酯的标准溶液分别于3个25mL的容量瓶中，分别用三种酒样定容至刻度（丙酸乙酯的浓度相当于3.07×10-4g/mL）。

3.2.3.2 样品中各组分浓度测定

利用上述方法测定，得到如下表1、表2、表3。分别显示了绵竹大曲、红星二锅头、老白干中各组分的浓度含量测定结果及结果的相对标准偏差。

表1 绵竹大曲中各组分的浓度含量测定

表2 红星二锅头中各组分的浓度含量测定

表3 老白干中各组分的浓度含量测定

3.3 精密度试验

待色谱仪基线稳定后，用5μL微量进样器吸取1μL标准使用液注入仪器中，依据各组分峰面积及浓度、丙酸乙酯(内标物)峰面积及浓度，计算各组分的校正因子[11]。每隔2.5个小时测定1次，连续测定5次，6种组分的峰面积见表4；相对校正因子及其相对标准偏差（RSD）结果见表5。

表4 五次测定的标准使用液的浓度及峰面积

表5 计算得到的相对校正因子及其相对标准偏差(RSD )

3.4 准确度试验（即加标回收率实验）

吸取5mL混合标准储备液于25mL容量瓶中，加入已知组分和浓度的酒样定容至刻度，根据测得组分浓度，计算其含有的各组分的质量，减去原酒样中各组分的质量，得出检出质量，计算回收率。三种酒样的回收率计算结果见表6、表7、表8。

表6 绵竹大曲的回收率

表7 红星二锅头的回收率

表8 老白干的回收率

3.5 甲醇的外标实验验证（标准曲线法验证）

3.5.1 步骤

（1）从甲醇的标准储备液中（甲醇的质量浓度为3.68×10-2g/mL），用1mL的胖肚移液管准确移取1mL的液体于25mL的容量瓶中，用去离子水定容到刻度，记为甲醇标准使用液。

（2）从甲醇标准使用液中准确移取：0.00mL；0.20mL；0.40mL；0.60mL；0.80mL一系列的标准使用液分别于5个10mL的容量瓶中，用去离子水定容至刻度。

（3）用5μL微量进样器准确移取1μL的各个浓度梯度的标准样注射到气相色谱仪器中，记录各浓度在色谱仪上的面积，见表9。

3.5.2 结果

表9 甲醇标准曲线测定

图5 外标测定甲醇标准曲线

以绵竹大曲为例：

两次进样的面积分别为： A1=7748 A2=9044

所对应的浓度为：

两者的相对标准偏差：

根据以上的计算可以得出内标法和标准曲线法计算得到的两者的相对标准偏差在10%以内，所以方法可用。

4 结论

本次实验研究出了用丙酸乙酯作为内标物，用气相色谱法快速准确的测量出饮料酒中的甲醇和杂醇油含量。该法分析酒中的甲醇、杂醇油具有快速、简便、准确的特点，适合于大批量样品测定。同时，此法还能测定酒中其他特征成分（正丙醇、正丁醇和乙酸乙酯），在气相色谱普及的今天，各地均具有使用该法的条件，因此，具有推广应用价值。

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The Methanol and Fusel Oil Analyzed by Gas Chromatography in Drink Wine

HUANG Zhen
(Fuzhou Product Quality Inspection,Fuzhou 350008, Fujian, China)

The determination of methanol and fusel oil (isobutene, isoamyl alcohol) using the ethyl propionate as the internal standard were detailedly studied. In order to improve the precision and accuracy, and save the time and cost. With the use of GDX-102 stainless steel column,hydrogen flame ionization detector, retention time and the internal standard of ethyl propionate. This experimental also determinated the content of ethyl acetate, 1-propane and 1-alcohol in liquor. The results were obtained: the method had high accuracy, 7 recovery rate of the components in the 90.1% ～108.8%; the reproducibility of the method precision is the relative standard deviations were 0% ～ 5.37%, which was accord with the requirement of national standard.

Gas chromatography; Ethyl propionate; Internal standard; Methanol;Fusel oil

2014-05-04

黄贞，女，福州市产品质量检验所，检定员