乙型肝炎病毒表面抗原对实体肿瘤患者CIK细胞诱导培养及表型分析的影响

马学斌，马 聪，邱 伟，赵健灵，袁红霞，杨 郡

乙型肝炎病毒表面抗原对实体肿瘤患者CIK细胞诱导培养及表型分析的影响

马学斌，马 聪，邱 伟，赵健灵，袁红霞，杨 郡

目的探讨乙型肝炎病毒表面抗原阳性患者与阴性患者细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）体外培养过程中个细胞增殖情况和淋巴细胞亚群的变化。方法选取海军总医院2012年10月－2013年6月住院的肿瘤患者，共50例，根据乙型肝炎病毒表面抗原表达情况分为阴性组和阳性组。分别抽取患者外周血进行CIK细胞诱导培养，在第1、5、7、9、11、13、15天进行细胞活力检测并计数，第5、7、10、13、15天进行各细胞亚群的表达分析。结果两组患者CIK增殖情况单个时间点比较无显著性差异，但是在第15天的增殖倍数阳性组显著高于阴性组（280倍比180倍）；细胞亚群分析中CD3＋T细胞、CD8＋T细胞、CD3＋CD8＋T细胞、CD3＋CD56＋T细胞比例均随培养时间延长而升高，CD4＋T细胞、CD3＋CD4＋T细胞随培养时间延长而降低，阳性组更显著；其中CD8＋T细胞和CD3＋CD4＋T细胞在两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论乙型肝炎病毒表面抗原阳性患者CIK细胞较阴性患者扩增能力更强，效应细胞表型表达更有利于杀伤作用的发挥。

乙型肝炎病毒表面抗原；细胞因子诱导的杀伤细胞；细胞亚群

我国是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的高流行区，15～59岁人群HBV表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）阳性率8.12%［1］，所有肿瘤患者血清HBsAg阳性率8.98%［2］。HBV感染是导致中国人群肝肿瘤发生的重要因素，同时也与其他肿瘤的发生发展具有很密切的关系。目前在对肿瘤进行的综合治疗中，细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一种新型的免疫效应细胞，由于其在体外增殖速度快、杀瘤谱广，对自体肿瘤细胞具有特异性识别能力，杀伤活性高不受主要组织相容性复合体限制，对正常骨髓前体细胞毒性很小，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感，可以抵抗肿瘤细胞引发的Fas-FasL凋亡等特点，受到了广泛的关注。有报道CIK细胞能够明显抑制HBV复制，安全无副作用［3］。但是对于HBsAg表达阳性与否对肿瘤患者外周血诱导培养的CIK细胞增殖能力及细胞表面分子表达的影响等，尚未见报道。本研究对此进行了初步分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取海军总医院2012年10月－2013年6月住院的中晚期恶性肿瘤患者50例，男性28例、女性22例，年龄（53.42±13.32）岁；其中，肺癌15例，肝癌10例，鼻咽癌7例，乳腺癌6例，胃癌3例，肾癌2例，宫颈癌2例，其他恶性肿瘤5例；所有患者均经过HBsAg、丙型肝炎病毒抗体、艾滋抗体和梅毒抗体检测，所有患者除HBsAg检测结果外，其他三项结果均为阴性。根据HBsAg检测结果将研究对象分为阳性组（14例）和阴性组（36例）。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 3111型CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司），4000型低速离心机（日本Kubota公司），BCM型生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），Epics XL MCL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），XE-2100全自动血液细胞分析仪（日本Sysmex公司），LX-20全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2.2 试剂 无血清淋巴细胞培养液（GT-T551，日本Taraka公司），人淋巴细胞分离液（天津美德太平洋科技有限公司），D-磷酸缓冲液（Dulbecco′sphosphate buffered saline，D-PBS，日本Taraka公司），重组人源化白细胞介素-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2，北京双露药业公司），干扰素γ（Interferonγ，IFN-γ，上海凯茂生物医药有限公司），CD3单克隆抗体（古巴分子免疫学中心），CD3、 CD4、CD8、CD56荧光标记抗体（美国Beckman Coulter公司），全血细胞分析试剂（日本Sysmex公司），XL-2100全自动血液细胞分析仪配套试剂，生化检测试剂（北京九强生物技术有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 治疗前淋巴细胞数量及相关生化指标的比较 在患者抽血进行CIK细胞培养的同时，取患者外周乙二胺四乙酸二钾（Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium，EDTA K2）抗凝静脉血2 mL，使用全自动血液细胞分析仪检测患者治疗前淋巴细胞数量；同时，采集患者非抗凝静脉血5 mL，待血液凝固后，离心分离血清，进行相关生化指标的检测。

1.3.2 CIK细胞的体外培养流程 所有入组患者签署知情同意书后，早晨空腹用真空采血管采集外周静脉血54 mL，在GMP实验室分离单个核细胞，用GT-T551无血清淋巴细胞培养液调整细胞浓度为1×106／mL，在每毫升细胞悬液中加入IFN-γ800 U／mL，加入10%的自体血浆，转入用5μg／mL CD3单抗预先包被的培养瓶中，放置37℃，5%CO2培养箱中培养；第2天添加培养液并加入rhIL-2 1 000 U／mL，期间根据细胞生长情况补充GT-T551培养液和相应的rhIL-2和自体血浆；培养至第5天，根据细胞生长增殖情况调整细胞密度，并转入GT-T610（A）透气培养袋进行扩大培养，每2～3 d根据细胞的生长增殖情况，补充GT-T551淋巴细胞培养液、相应的rhIL-2和自体血浆。分别于培养后的第5、7、10、13、15天进行细胞表型分析，用胎盘蓝染色法检测细胞活力并计数；在培养的第13～15天，分3 d连续收集所有细胞，经洗涤后配成200mL的细胞悬液，加入适量的白蛋白和白介素-2（interleukin-2，IL-2），混匀后送病房给患者回输。

1.3.3 流式细胞术检测CIK细胞的淋巴细胞亚群

于CIK细胞培养的第5、7、10、13、15天分别采取培养的细胞，加入适量的异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、或藻红蛋白-花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）标记的混合抗体，包括CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5、CD3-FITC／CD56-PE。轻轻震荡混匀后，室温避光孵育20 min，加入PBS，颠倒混匀后1 500 r／min离心8 min，弃上清液，沉淀中加入适量PBS混悬细胞后，流式细胞仪检测，每份样本分析细胞数≥5× 104个，采集的数据使用流式细胞仪配套软件进行分析。

1.3.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料均采用均数±标准差（¯x±s）表示，计量数据组间比较采用单因素方差分析和多元方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般情况 两组比较淋巴细胞、白蛋白、谷丙转氨酶、总胆红素、直接胆红素 F分别为4.415、6.378、9.300、6.623、5.502，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 两组一般情况

2.2 两组患者CIK细胞增殖数量 在CIK细胞增殖培养的第1、5、7、9、11、13、15天分别混匀培养中的细胞，取样检测细胞活力和细胞密度，计算细胞总数。细胞活力均≥98%，细胞计数两组比较差异无统计学意义（表2），细胞生长曲线见图1。两组患者CIK细胞的增殖，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组CIK细胞均在第7天左右开始进入快速增长期；至培养检测的第15天，两组CIK细胞仍处于对数生长阶段，但是阳性组细胞数约为初始的280倍，高于阴性组的180倍。

表2 两组患者CIK细胞增殖数量（×107个）

图1 两组CIK细胞生长曲线

2.3 诱导培养过程中淋巴细胞亚群 在培养过程中，分别于第5、7、10、13、15天收取两组患者的CIK细胞，检测淋巴细胞表面表型的变化。结果显示，两组患者的CIK细胞中CD3＋T细胞、CD8＋T细胞、CD3＋CD8＋T细胞、CD3＋CD56＋T细胞比例均随培养时间延长而呈升高的趋势，其中阳性组升高较阴性组；CD4＋T细胞、CD3＋CD4＋T细胞随培养时间延长而呈逐渐降低的过程，阳性组降低较阴性组更多（表3，图2、3）。经多因素方差分析，结果显示CD8＋T细胞比例的升高和CD3＋CD4＋T细胞比例的降低在两组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 不同培养时间两组肿瘤患者CIK细胞的表型变化（%）

图2 两组单阳细胞比率随时间延长的变化

图3 两组患者CIK细胞表型随时间延长的变化

3 讨论

免疫疗法有助于获得HBsAg血清学转阴，恢复或改善缺陷的T细胞抗病毒免疫反应，CIK细胞治疗对于HBV DNA复制具有抑制作用，CIK细胞回输后可以使慢性乙型肝炎患者HBV DNA水平明显下降，CIK细胞治疗后患者病毒载量明显下降者其CIK效应细胞CD3＋CD56＋T细胞比例明显高于治疗无应答者，提示免疫细胞数量和功能恢复与机体抗病毒能力的密切相关［4］。在肿瘤的发生发展过程中，多种因素影响肿瘤的发展和转归［5-6］。本研究在免疫细胞治疗恶性肿瘤的临床应用过程中发现，HBsAg阳性表达者在细胞回输治疗中的效果似乎要优于HBsAg阴性表达者，为了深入研究HBsAg血清学水平对CIK细胞增殖的影响，我们对在海军总医院进行生物治疗的50例肿瘤患者的CIK细胞培养过程中的原始数据进行初步的分析研究。

对于入组患者初始的淋巴细胞计数，阳性组的数量要显著的低于阴性患者，且阳性组患者的白蛋白、谷丙转氨酶、总胆红素和直接胆红素水平都要显著高于阴性组患者的平均水平，显示了HBsAg阳性表达对于患者的一般状况是一个负性的影响，这与HBV的存在会影响人体的健康状况是一致的［7-8］。对于来自组两组患者的CIK细胞的增殖情况，结果显示不论是HBsAg阳性或者阴性，CIK细胞的增殖都是大约从第7天开始进入快速增长期，在细胞数量的增殖上相同时间点两组比较没有显著性差异，但是第15天阳性组细胞的增殖倍数较第1天要高于阴性组（280倍比180倍），对于这一原因的分析认为阳性组患者的淋巴细胞除与肿瘤细胞接触被活化和识别外，还与HBV有接触，接受双重的刺激和激活，从而推测其可能具有更强的识别能力和杀伤活性［9］，在体外受到进一步的刺激和活化时，更容易生长和增殖，因此在第15天的增殖倍数阳性组要显著高于阴性组。

对淋巴细胞表面标志的研究结果，CD3＋T细胞、CD8＋T细胞、CD3＋CD8＋T细胞、CD3＋CD56＋T细胞均随着培养时间延长而升高，升高程度阳性组优于阴性组；CD4＋T细胞、CD3＋CD4＋T细胞随着培养时间的延长而降低，降低程度阳性组优于阴性组。经过多元方差分析，其中差异有统计学意义的是CD8＋T细胞和CD3＋CD4＋T细胞（P＜0.05），其余差异没有统计学意义。对于这一现象的分析，由于在CIK这个异质性细胞群中，主要的效应细胞是CD3＋CD8＋T细胞和CD3＋CD56＋T细胞，在阳性组中CD3＋CD8＋T细胞升高较阴性组更为显著；而CD3＋CD4＋T细胞属于抑制细胞，对于CIK细胞发挥杀伤作用具有抑制作用［10］，因此在培养过程中，把CD3＋CD4＋降到最低是提高效应细胞杀伤活性的重要环节，通过我们的研究分析可以看出，在阳性患者组中，CD3＋CD4＋T细胞的比例降低较阴性组更为显著，这为HBsAg阳性患者CIK细胞回输后具有更好的治疗效果提供了理论依据。关于CIK细胞培养技术，也有认为白介素-6的加入可以降低其中抑制细胞的比例，增加效应细胞的增值和毒性［11］，具有更好的效果。

免疫治疗对于恶性肿瘤及HBV的治疗都是一种很有前途的治疗策略［12-15］，如何有效地提高治疗效果，更好地发挥其抗肿瘤和抗病毒作用，将是这一领域的研究热点，我们的分析研究样本有限，还需要进一步扩大样本深入研究。

［1］崔富强，张国民，孙校金.中国15～59岁人群乙型肝炎病毒感染易感性分析［J］.江苏预防医学，2013，24（4）：1-3.

［2］王慜杰，李学祥，韩彬彬，等.10 724例肿瘤患者HBsAg检测结果分析［J］.中国肿瘤，2010，19（9）：623-625.

［3］Shi M，Fu J，Shi F，et al.Transfusion of autologous cytokine-induced killer cells inhibits viral replication in patients with chronic hepatitis Bvirus infection［J］.Clin Immunol，2009，132（1）：43-54.

［4］汤紫荣，施明，张冰，等.自体CIKs治疗对乙肝病毒的抑制作用及机制分析［J］.解放军医学杂志，2011，36（9）：901-903.

［5］阮健，罗荣城.肿瘤转移的微环境及其临床意义［J］.转化医学杂志，2012，1（2）：111-114.

［6］Zheng YW，Li RM，Zhang XW，et al.Current adoptive immunotherapy in non-small cell lung cancer and potential influence of therapy outcome［J］.Cancer Invest，2013，31（3）：197-205.

［7］Wang H，Xue L，Yan R，et al.Comparison of FIB-4 and APRI in Chinese HBV-infected patients with persistently normal ALT and mildly elevatedALT［J］.J Viral Hepat，2013，20（4）：e3-e10.

［8］Sarin SK，Kumar M.Should chronic HBV infected patients with normal ALT treated：debate［J］.Hepatol Int，2008，2（2）：179-184.

［9］Pan CC，Huang ZL，Li W，et al.Serum alpha-fetoprotein measurement in predicting clinical outcome related to autologous cytokine-induced killer cells in patients with hepatocellular carcinoma undergone minimally invasive therapy［J］.Chin JCancer，2010，29（6）：596-602.

［10］Ma Y，Zhang Z，Tang L，et al.Cytokine-induced killer cells in the treatment of patients with solid carcinomas：a systematic review and pooledanalysis［J］.Cytotherapy，2012，14（4）：483-493.

［11］Lin G，Wang J，Lao X，et al.Interleukin-6 inhibits regulatory T cells and improves the proliferation and cytotoxic activity of cytokine-inducedkiller cells［J］.J Immunother，2012，35（4）：337-343.

［12］Jiang J，Wu C，Lu B.Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity［J］.JTransl Med，2013，11：83.

［13］Yang L，Ren B，Li H，et al.Enhanced antitumor effects of DC-activated CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non-small-cell lung cancer patients［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62（1）：65-73.

［14］Dong M，Liang D，Li Y，et al.Autologous dendritic cells combined with cytokine-induced killer cells synergize low-dose chemotherapy inelderly patients with acute myeloid leukaemia［J］.J Int Med Res，2012，40（4）：1265-1274.

［15］Zhang J，Zhu L，Wei J，et al.The effects of cytokine-induced killer cells for the treatment of patients with solid tumors：a clinical retrospectivestudy［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（6）：1057-1062.

Effects of hepatis B vines on the grow th and cell subsets analysis of cytokine-induced killer cells（CIK）in vitro incubation from tumor

MA Xuebin1，2，MA Cong1，2，QIUWei1，ZHAO Jianling1，YUAN Hongxia1，YANG Jun1
（1.Biology Treatment Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，Chin；2.Department of Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo explore the difference of the immune cell subsets during the process of cytokine-induced kill cells（CIK）incubation from tumor patients with and without hepatitis B virus.MethodsThe peripheral blood was extracted from 50 tumor patients from Oct 2012 to Jun 2013 who were divided into two groups by with or without hepatitis B virus.The proliferate velocity and activity of CIK cellswere detected by count on 1，5，7，9，11，13 and 15 days of the CIK culture.The expressions of CD3＋，CD4＋，CD8＋，CD3＋CD8＋，CD3＋CD4＋，CD3＋CD56＋T cells were analyzed by flow cytometry on 5，7，10，13 and 15 days of the culture.ResultsThe proliferative multiple at15 days in HBV positive group was higher than that of negative group（280 vs.180），although there was no significant difference between the two groups at the same culturing time points. The frequencies of CD3＋T cells，CD8＋T cells，CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD56＋T cells increased by the time，whilethe CD4＋T cells and CD3＋CD4＋T cells decreased by the time，the positive group was more than the negative.Among them，the difference of CD8＋T cells and CD3＋CD4＋T cells in two groups was significant（P＜0.05）.ConclusionThe proliferate multiple capacity of CIK cells from patients with HBV positive group was better than that of negative group，and the immune cell subsets states of HBV positive group was better than that of negative group..

Hepatitis B virus surface antigen；Cytokine-induced killer cells；Immune cell subset

R392.11；R392.12

B

2095-3097（2014）01-0022-05

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.01.006

2013-06-30 本文编辑：冯 博）

100048北京，海军总医院生物治疗中心（马学斌，马 聪，邱 伟，赵健灵，袁红霞，杨 郡），检验科（马学斌，马 聪）

马 聪，E-mail：macong958166＠163.com