雏番鸭沙门氏菌的分离与鉴定

陈红梅 程龙飞 傅光华 施少华 万春和 傅秋玲 黄瑜

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

雏番鸭沙门氏菌的分离与鉴定

陈红梅 程龙飞 傅光华 施少华 万春和 傅秋玲 黄瑜＊

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

2014年10月，福建某番鸭场因患疑似鸭沙门氏菌病导致雏番鸭大量死亡，为确诊雏番鸭死亡原因，对送诊的死亡雏番鸭进行细菌分离、生化鉴定和针对沙门氏菌fimW基因作PCR鉴定，并对分离菌进行药敏试验以及动物回归试验，试验结果表明：引起雏番鸭死亡的原因是鸭沙门氏菌病。

雏番鸭 沙门氏菌 分离鉴定

鸭沙门氏菌病又称为鸭副伤寒，是由鼠伤寒等几种沙门氏菌所引起的疾病总称，主要引起雏鸭发病，发病雏鸭多呈急性或亚急性经过，引起大批死亡，成年鸭则常为慢性经过或耐过[1]。2014年10月，福建某番鸭场因患疑似鸭沙门氏菌病导致雏番鸭大量死亡，死亡番鸭的病变表现为心包炎，肝脏肿大，肠黏膜坏死，盲肠肿胀，内有栓子。为确诊雏番鸭死亡原因，对送诊的死亡雏番鸭进行细菌分离、生化鉴定和针对沙门氏菌fimW基因作PCR鉴定，并对分离菌进行药敏试验以及动物回归试验。

1 材料与方法

1.1 病料样品病料样品来源于福建省某番鸭场的病死雏番鸭。

1.2 主要试剂细菌生化反应管与药敏试纸均购自杭州天和微生物试剂有限公司；其他试剂均为分析纯；普通营养琼脂培养基、SS培养基、麦康凯琼脂培养基以及普通肉汤自制。

1.3 试验动物试验动物为购置健康鸭场1日龄的雏番鸭。

1.4 细菌的分离培养与纯化无菌条件下取死亡雏番鸭的肝脏接种于普通营养琼脂培养基、SS培养基和麦康凯琼脂培养基，37℃培养18～24 h后取出，挑取其中单一的菌落进行纯化，再将纯化后的菌落于普通肉汤中37℃、150 r/min进行振荡培养。

1.5 革兰氏染色镜检采用常规方法进行革兰氏染色，普通光学显微镜下观察菌体形态。

1.6 生化试验挑取纯培养的单菌落接种细菌生化微量鉴定管，37℃培养24 h观察生化试验结果。

1.7 药敏试验采用纸片扩散法，检测分离菌株对18种常用抗菌药物的敏感性。判断标准参照中国药检所制定的标准。

1.8 动物回归试验购进1 d健康雏番鸭20羽，饲养7 d后进行试验。随机选取10羽通过腿部肌肉注射0.2 mL/羽（4.5×109CFU/mL）分离菌肉汤培养液，另外10羽注射等量的生理盐水作为试验对照。每天观察两次并记录其发病情况。雏番鸭发病死亡后剖检观察，记录其病理变化，同时在无菌条件下取死鸭肝脏接种于普通营养琼脂平板进行细菌的分离培养。

2 结果

2.1 细菌分离与培养特性观察普通营养琼脂上长出细小、湿润、半透明的菌落，SS培养基上长出黑色小菌落，而麦康凯琼脂培养基上长出无色、透明、圆形、光滑、针尖大小的菌落。经革兰氏染色后，镜下观察可见分离菌为革兰氏阴性、无芽孢、无荚膜小杆菌。2.2生化试验所分离的细菌使葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖均发酵产酸产气，不发酵乳糖、蔗糖、麦芽糖，产生硫化氢，不产生吲哚，枸橼酸盐与甲基红试验阳性，V-P试验为阴性（见表1）。这些与沙门氏菌的生化特性相符。94℃30 s、53℃30 s、72℃45 s，35个循环；72℃10 min。取PCR产物5 μL，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，应用凝胶成像系统进行观察拍照。将PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化后与载体pMD18-T连

表1 分离菌的生化反应结果

2.3 药敏试验该分离菌对庆大霉素、头孢唑啉、氧氟沙星、壮观霉素、丁胺卡那高敏；对恩诺沙星、氟哌酸、环丙沙星、卡那霉素、罗红霉素、新霉素中敏，对氨苄青霉素、阿莫西林、复方新诺明等低敏。见表2。

表2 分离菌药敏试验结果

2.4 PCR鉴定参照文献[2]合成一对可特异性扩增沙门氏菌fimW基因的引物。

上游引物：5'-AACAGTCACTTTGAGCATGGGTT-3'；下游引物：5'-GAGTGACTTTGTCTGCTCTTCA-3'。

预期扩增片段为477 bp，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

用常规方法提取分离菌的DNA，用所设计的特异性引物进行PCR扩增，扩增体系为50 μL，其中2×GoTaq Master Green Mix 25 μL、上下游引物（20 μm/mL）各1 μL、DNA模板1μL，补充灭菌去离子水至总体积50 μL。反应程序是94℃5 min；接，转化至DH5α感受态细胞，用PCR方法鉴定重组质粒，阳性重组质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

图1 分离菌PCR电泳结果（注：M.Marker(DL2000)；1.分离菌；2.鸭疫里默氏菌；3.大肠杆菌；4.空白对照）

2.5 动物回归试验接种7 h后试验组雏番鸭开始出现死亡，26 h内试验组雏番鸭全部死亡，而对照组雏番鸭健康。剖检死亡番鸭，可见肝脏肿大、表面有灰白色坏死点，盲肠肿大，并从死亡番鸭的肝脏中重新分离到该菌。

3 讨论与小结

1）鸭沙门氏菌病主要引起3周龄以下的雏鸭（尤其是10日龄内的）发病，属于一种急性和慢性传染病，急性常呈地方流行，鸭沙门氏菌病属于人畜共患病，具有重要公共卫生意义[1-3]。

2）本试验对送诊的病死鸭进行了细菌分离及实验室诊断，经革兰氏染色镜检、细菌培养性状观察、生化反应以及PCR鉴定和动物回归试验，引起该番鸭场大批雏番鸭死亡的病因为鸭沙门氏菌病。

3）目前由于抗生素使用过量，沙门氏菌普遍存在耐药性，应当参照药敏试验的结果选择敏感的药物进行对症治疗，最大限度地减少养殖户的损失。本试验所分离的沙门氏菌对庆大霉素、头孢唑啉、氧氟沙星、壮观霉素、丁胺卡那高敏；对恩诺沙星、氟哌酸、环丙沙星、卡那霉素、罗红霉素、新霉素中敏，对氨苄青霉素、阿莫西林、复方新诺明等低敏。

4）应用PCR方法对鸭沙门氏菌病进行快速诊断，可大大缩短实验室诊断的时间，加快对疾病的诊断，提供准确的鉴定结果。

5）对于沙门氏菌病的防治，主要做好以下两点：首先严格做好孵化场的卫生，保证防止种蛋孵化过程被污染，在源头上切断沙门氏菌的污染；其次做好鸭场的卫生，确保鸭场通风和干燥，及时隔离患鸭[1-3]。

[1]陈伯伦,陈育濠,陈伟斌,等.鸭病[M].北京:中国农业出版社,2008.

[2]张江英,董立伟,王小舟,等.针对fimW基因沙门氏菌的特异性PCR检测[J].中国预防兽医学报,2013,35(10):837-839.

[3]王傲雪,张凌云,张桉潮,等.肉鸡沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医,2013,40(7):167-171.

Isolation and identification of Salmonella from Muscovy ducklings

Chen Hongmei Cheng Longfei Fu Guanghua Shi Shaohua Wan Chunhe Fu Qiuling Huang Yu*
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science; Fujian Animal Disease Control Technology Development Center,Fuzhou 350013）

In October 2014,a high mortality of Muscovy ducklings occurred in a Muscovy duck farm of Fujian.To identify the pathogen,a sample is taken from dead Muscovy duckings suspected to be Salmonellosis.The pathogenic isolate was identified to be Salmonella based on physiological and biochemical tests and amplifications of fimW(477 bp)gene and animal regression experiment. The test results show that the cause of death of the Muscovy duck is salmonellosis.

Muscovy ducklings Salmonella Isolation and identification

A

1003-4331（2014）06-0001-03

陈红梅（1979-），硕士，助理研究员，从事畜禽传染病研究。E-mail:chenhmei052@126.com。

＊通信作者：黄瑜（1965-），博士，研究员，从事畜禽传染病研究。E-mail:huangyu_815@163.com。