不同方法提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA效果的比较分析

吴蔚 詹文辉 李鹤 应清香 廖媛 王邦彦 福建省南平市动物疫病预防控制中心 353000

不同方法提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA效果的比较分析

吴蔚 詹文辉 李鹤 应清香 廖媛 王邦彦 福建省南平市动物疫病预防控制中心 353000

高致病性禽流感以及新城疫对禽养殖户危害巨大，应用荧光RT-PCR方法对高致病性禽流感、新城疫病毒进行检测在病原学检测中占据优势。而荧光RT-PCR检测的核心是核酸物质的提取。本文将离心柱内硅基质膜提取法（柱膜法）与磁珠法作比较，探讨更适合基层兽医实验室的核酸提取方式。

柱膜法 磁珠法 提取 比较

高致病性禽流感（以禽流感H5、H7为代表）及新城疫对禽养殖户危害巨大，均属于我国规定的一类动物疫病。RT-PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术[1]，通过荧光信号的变化检测高致病性禽流感及新城疫病毒RNA，为我国目前较为准确的检测手段。而提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA有多种方法[2]，离心柱内硅基质膜提取法（以下简称“柱膜法”）与磁珠法是各种方法中的佼佼者，本文将这两种方法作比较，阐述如下。

1 材料与方法

1.1 样本与试剂样本分别为禽流感H5、H7及新城疫阳性、阴性对照品（深圳凯杰生物工程有限公司）。柱膜法采用凯杰生物的试剂盒，磁珠法采用天隆科技的试剂盒。

1.2 仪器微量可调节移液器、高速台式冷冻离心机、核酸提取仪NP968型（西安天隆科技有限公司）、PCR荧光检测仪（凯杰生物工程有限公司）。

1.3 方法

1）以禽流感H5为例：将禽流感H5阳性对照品、阴性对照品分为两组，一组用柱膜法提取RNA，另一组用磁珠法提取RNA。柱膜法的提取过程为：化学裂解-过柱吸附-洗涤-洗脱，全程人工提取，在生物安全柜内操作。磁珠法的提取过程为：化学裂解-加磁珠吸附-洗涤-洗脱，由核酸提取仪半自动操作。样本分别经过柱膜法和磁珠法处理后，提取的产物（洗脱产物）均加入扩增试剂（RT-PCR反应液、RT-PCR酶、Taq酶），分装，放入PCR荧光检测仪内设置好循环条件同时进行RT-PCR反应，反应完成后根据样本Ct值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。

2）禽流感H7和新城疫的RNA提取过程同禽流感H5，检测样本换成禽流感H7及新城疫阳性、阴性对照品。

2 结果

高致病性禽流感、新城疫病毒荧光RT-PCR的结果分别见图1-图3。

2.1 两种方法提取禽流感病毒H5的比较柱膜法提取的阳性对照品（1号线）的Ct值为17.43，磁珠法提取的阳性对照品（2号线）的Ct值为14.42，柱膜法和磁珠法分别提取的阴性对照品（3、4号线）的Ct值均为none。见图1。

图1 两种方法提取禽流感H5病毒RNA效果的比较

2.2 两种方法提取禽流感病毒H7的比较柱膜法提取的阳性对照品（1号线）的Ct值为18.75，磁珠法提取的阳性对照品（2号线）的Ct值为15.14，柱膜法和磁珠法分别提取的阴性对照品（3、4号线）的Ct值均为none。见图2。

图2 两种方法提取禽流感H7病毒RNA效果的比较

2.3 两种方法提取新城疫病毒的比较柱膜法提取的阳性对照品（1号线）的Ct值为14.00，磁珠法提取的阳性对照品（2号线）的Ct值为11.45，柱膜法和磁珠法分别提取的阴性对照品（3、4号线）的Ct值均为none。见图3。

3 分析与讨论

1）结果表明，无论是柱膜法还是磁珠法，均对高致病性禽流感及新城疫病毒RNA有较好的提取效果。因为图1-图3所示的阳性对照品的Ct值均小于30，而阴性对照品的Ct值均为none。

图3 两种方法提取新城疫病毒RNA效果的比较

2）由于是直接用阳性对照品和阴性对照品作为样本来进行，基本排除了样本因素[3]（如样本溶血等）对本试验的影响。因条件所限，没有设立已知拷贝数的样品进行绝对定量的分析[4-5]，故无法计算出使用这两种方法提取的起始模板量，待将来作进一步研究讨论。

3）从图1-图3可以看出，采用柱膜法提取的组分的Ct值均大于采用磁珠法提取的组分的Ct值，一般差2～3个循环。而Ct值越大则表明在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数越大，这就意味着相对磁珠法来说，采用柱膜法提取的效果略差。

4）两种方法虽然在试验结果上略有差异，但并不影响基层兽医实验室对高致病性禽流感及新城疫病毒检测定性的要求。柱膜法基本通过人工操作，对人员以及环境要求较高，且操作较为繁琐，但费用较磁珠法少。磁珠法通过仪器的精密控制，减少了人工操作环节引起的差异和错误，通量较大，一次可以同时处理32个样本（最多可处理96个样本），但处理每个样本的成本较高。因此，在基层兽医实验室的实际应用过程中，应当根据自身情况选择合适的方法来进行高致病性禽流感及新城疫病毒RNA的提取。

[1]杨新,刘泽军.实时荧光定量RT-PCR定量分析mRNA表达水平原理及应用[J].中国检验医学与临床,2003,4(2): 78-80.

[2]张丽,杨莲茹,吴绍强.核酸提取方法的研究进展[J].中国动物检疫,2011,28(12):75-78.

[3]高国生,姜俊,翁彭剑.不同标本因素对荧光定量PCR法测定HBV DNA结果的影响[J].现代实用医学,2010,22(1): 37-38.

[4]卢体康,秦智锋,陈兵,等.H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2012,33 (3):9-13.

[5]孙军峰,刘华雷,张维,等.体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模版[J].中国畜牧兽医,2010(4): 43-46.

Comparison of different RNA isolation methods for Highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease

Wu Wei Zhan Wenhui Li He Ying Qingxiang Liao Yuan Wang Bangyan
（Nanping Center for Animal Disease Control and Prevention,Fujian 353000）

Highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease do the great harm to poultry farmers,FQ-PCR have an advantage in detecting method of etiology and Nucleic acid extraction is the key.This article compares Centrifugal column extraction with magnetic bead method in order to find a better way in Basic veterinary laboratory.

Centrifugal column extractionmagnetic bead methodExtractionComparison

A

1003-4331（2014）06-0007-02