stim1和orai1蛋白在哮喘大鼠支气管平滑肌中的表达

王 丽，丁圣刚，李忠强，王亚亭

stim1和orai1蛋白在哮喘大鼠支气管平滑肌中的表达

王 丽1，丁圣刚1，李忠强2，王亚亭1

目的研究基质交感分子1（stim1）和钙离子释放激活钙离子通道蛋白1（orai1）在哮喘气道平滑肌细胞中表达水平的变化。方法选取40只清洁级SD大鼠随机分为对照组和哮喘组，其中哮喘组用鸡卵清蛋白（OVA）激发制备大鼠哮喘模型（n＝20），对照组用生理盐水代替（n＝20）。肺组织病理切片HE染色判断哮喘模型是否建立成功，分析支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞总数及分类计数，应用免疫组化技术及彩色病理图文分析系统测定stim1和orai1蛋白阳性细胞平均光密度值。结果肺组织病理切片HE染色镜下观察呈现大量炎细胞浸润，支气管黏膜肿胀，支气管腔内可见黏液栓等，证实哮喘模型建立成功。哮喘组中大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。哮喘组大鼠支气管平滑肌表达orai1蛋白阳性细胞平均光密度值明显高于对照组（P＜0.05）。哮喘组和对照组大鼠支气管平滑肌表达stim1蛋白阳性细胞的平均光密度值无明显差异（P＞0.05）。结论orai1蛋白在哮喘大鼠气道平滑肌细胞中表达变化较stim1蛋白明显，对支气管平滑肌调节作用可能更重要。

基质交感分子1；orai1蛋白；哮喘；平滑肌细胞

钙库调控钙离子内流（store operated calcium entry，SOCE）在机体生理、病理活动中起着重要作用，参与细胞的生长、迁移、增殖与分化，同时与机体免疫细胞、炎症细胞以及结构细胞发挥作用有密切关系［1－2］。钙离子释放激活钙离子通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel protein 1，orai1）和基质交感分子1（stromal interaction molecule l，stim1）是构成SOCE的重要分子，orai1被公认为介导SOCE通道中Ca2＋内流的离子通道，stim1被认为是胞内钙库Ca2＋的“传感器”，Ca2＋敏感区是细胞内质网（endoplasmic reticulum，ER）腔内的EF-hand结构。支气管哮喘的发生、发展与机体慢性炎症和长期免疫应答反应有密切关系。该研究旨在探讨orai1蛋白在哮喘大鼠气道平滑肌细胞中表达变化，以期证实构成SOCE的orai1和stim1与支气管哮喘的发生、发展存在的联系。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠40只，清洁级，雄性，体重100～130 g，购自安徽医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂与仪器鸡卵清蛋白（OVA）购自美国Sigma公司；氢氧化铝粉购自上海凌峰化学试剂有限公司；orai1和stim1一抗抗体购自美国Abcam公司；羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠哮喘模型的建立 参照文献［3］方法，取清洁级SD大鼠40只，随机分为对照组和哮喘组。哮喘组于第1、8、15天分别腹腔注射10%OVA溶液1 ml（含100 mg OVA和100 mg氢氧化铝）进行致敏，对照组用生理盐水代替腹腔注射；哮喘组于第16天起雾化吸入含有1%OVA生理盐水1 ml，每次30 min，共7 d，激发哮喘，使其出现打喷嚏、喘息、呼吸急促或呼吸困难等表现；对照组用生理盐水代替雾化吸入，吸入时间相同。

1.3.2 标本的留取 最后一次雾化吸入后24h内，用3%戊巴比妥（0.3 ml/100 g）腹腔注射进行麻醉，麻醉后行开胸手术，分离周围组织，充分暴露左右主支气管，结扎右肺主支气管，并切取右肺叶，置于装有4%多聚甲醛溶液中充分浸末备用。

1.3.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）的留取 左肺予以生理盐水3 ml灌洗，重复进行3次，每次灌洗时间持续30 s，将回抽的灌洗液放入离心管，经4℃1 000 r/min离心10 min，离心后弃去上清液，将沉淀细胞用Hanks液洗涤离心2次，弃去上清液，加入Hanks液吹打混匀制成细胞悬液，细胞悬液涂片经HE染色后用改良牛氏血细胞计数板做细胞计数。

1.3.4 石蜡切片HE染色 将浸入4%甲醛溶液固定的新鲜肺组织，24h后制作蜡块，后用切片机连续切片，厚度为5 μm。常规用脱蜡、乙醇梯度脱水，行HE染色，光镜下观察肺脏组织病变情况。

1.3.5 石蜡切片免疫组化 将肺组织切片放在90℃恒温箱中烘烤10 min后，常规用脱蜡、乙醇梯度脱水，PBS冲洗后分别应用orai1和stim1蛋白免疫组化试剂盒，羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体作为标记二抗，依次按步骤选取比较完整的支气管，显微镜下观察计数表达orai1和stim1蛋白的阳性细胞，并随机选取5个高倍视野，进行彩色病理图文分析系统测定orai1和stim1蛋白阳性细胞平均光密度值。

1.4 统计学处理采用SPSS 11.0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。

2 结果

2.1 大鼠肺部组织形态学观察行HE染色后，镜下观察哮喘组大鼠肺脏组织，表现为支气管黏膜肿胀，内膜皱襞增多，部分上皮细胞破坏、脱落，杯状细胞增生，平滑肌层增厚，管壁增厚，管腔狭窄，黏液分泌增多，可见黏液栓形成，管壁周围见大量炎症细胞浸润；对照组则未见上述炎性改变，仅有少许炎症细胞浸润，支气管腔内少许分泌物。见图1。

图1 两组大鼠肺部组织表达 HE×200

2.2 支气管BALF涂片HE染色细胞计数两组大鼠BALF中均含有中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等，与对照组比较，哮喘组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组大鼠BALF中细胞计数及分类（n＝20，±s）

表1 两组大鼠BALF中细胞计数及分类（n＝20，±s）

项目哮喘组对照组t值P值细胞总数（×106/L）110.70±27.5650.00±19.77 0.581 0.000中性粒细胞（×106/L）28.80±5.075.50±2.643.403 0.000嗜酸性粒细胞（×106/L）7.80±2.251.60±1.084.033 0.000

2.3 支气管平滑肌orail和stim1表达与对照组相比，哮喘组大鼠支气管平滑肌细胞及其周围组织均有orai1蛋白阳性细胞表达，呈棕黄色颗粒，支气管平滑肌细胞平均光密度值明显升高（0.099±0.025 vs 0.072±0.014，P＜0.05）；哮喘组大鼠支气管平滑肌细胞及其周围组织均有stim1蛋白阳性细胞的表达，呈棕黄色颗粒，支气管平滑肌细胞的平均光密度值与对照组比较差异无统计学意义（0.093 ±0.025 vs 0.088±0.017，P＞0.05）。见图2。

图2 orai1、stim1蛋白免疫组化检测

3 讨论

气道平滑肌细胞是哮喘发作时气道结构变化的主要效应细胞，被认为是气道高反应性的结构基础，同时中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞等多种细胞和细胞组分也参与哮喘的慢性炎症反应。Baryshnikov et al［4］利用siRNA法敲除大鼠血管平滑肌细胞及人主动脉血管平滑肌细胞中的stim1和（或）orai1蛋白降低细胞的SOCE活性，明显抑制平滑肌细胞的增殖及细胞外Ca2＋内流，进而使中性粒细胞的炎症反应活性降低，肥大细胞脱颗粒及释放炎症介质减少，淋巴细胞克隆分化减弱［5－8］。

有研究［9］表明orai1和stim1两种蛋白是构成SOCE通路的重要组成部分，在细胞静息状态下stim1和orai1蛋白分别均匀地分布在内质网膜和细胞膜上，胞外激动剂作用于G蛋白偶联受体（G protein-linked receptor，GPCR）活化磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）产生三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），IP3与细胞内钙库IP3受体（IP3 receptor， IP3R）结合，使钙库开放，钙库迅速释放Ca2＋流入胞质，并出现钙库损耗状态，stim1蛋白感受钙库的充盈状态，stim1蛋白在内质网膜上重新排列，在靠近细胞膜的内质网膜上聚集［10－11］，将细胞内钙库耗竭信号，传递给位于细胞膜上的orai1蛋白，orai1蛋白活化且表达增多，形成功能性钙离子通道，促使胞外Ca2＋内流。

哺乳动物细胞中还有两个orai1的同源蛋白：orai2、orai3，在HEK293细胞研究［12］显示所有的orai蛋白都能增加SOCE，其中orai1功效最强，且是构成SOCE通道的重要组成部分，介导Ca2＋的内流。本研究结果显示哮喘组支气管平滑肌细胞内表达orai1蛋白的阳性细胞平均光密度值明显高于对照组，提示在哮喘发作时，气道平滑肌细胞经过G蛋白偶联受体信号转导途径，使钙库开放，并出现钙库耗竭，stim1作为胞内钙库Ca2＋的“传感器”，介导Ca2＋内流的离子通道开放，胞外Ca2＋流入胞内，填充胞内钙库，以维持气道平滑肌细胞内外钙离子平衡及其收缩功能。利用RNA干扰技术沉默orail蛋白后可显著抑制毒胡萝卜素或环匹阿尼酸清空钙库引起的Ca2＋内流，从而抑制平滑肌Ca2＋内流，充分证实这一观点［9］。

stim1被证明是细胞内Ca2＋的传感器，检测细胞内Ca2＋含量。目前已发现stim分子有stim1和stim2两种亚型［13－14］。stim1在SOCE通道活性中有重要作用，钙库排空之前stim1定位在内质网膜上，随胞内钙库排空，stim1在靠近细胞膜的内质网膜上以“斑”状重新聚集［14－15］，Ca2＋敏感区EF-hand结构域的基因突变，可能会降低其与Ca2＋的亲和力，使stim1蛋白对未排空的钙库敏感，导致SOC非钙库调控的激活［4］。本研究结果显示哮喘组支气管平滑肌细胞表达stim1蛋白阳性细胞平均光密度值与对照组比较无明显差异，然而Potier et al［1］在研究细胞生长过程中发现，在哮喘大鼠的气道平滑肌细胞中stim1的表达较对照组大鼠的表达增多，所以stim1蛋白在气道平滑肌细胞中作用机制仍需进一步探讨。

综上所述，stim1和orai1蛋白作为SOCE通路的重要组成部分，在哮喘气道平滑肌细胞中表达水平的变化，可能对气道平滑肌收缩功能起到重要作用，且orai1蛋白对支气管平滑肌调节作用更重要，SOCE通道可能参与哮喘的发生、发展，其作用机制仍需进一步研究。

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The expression of stim1 and orai1 protein in asthmatic rats airway smooth muscle cells

Wang Li1，Ding Shenggang1，Li Zhongqiang2，et al
（1Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Pediatrics，Linyi City People′s Hospital，Linyi 276000）

ObjectiveTo investigate the changes of stim1 and orai1 protein in the level of expression in asthmatic airway smooth muscle cells.Methods40 SD rats were randomly divided into normal control group and asthma group，and asthma model was established by OVA sensitization in rats.HE staining of lung tissue to determine whether the asthma model successfully established.Cell counting and classification were obtained in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of rats，immunohistochemical detection and color graphic analysis system was used to measure the expression of stim1 and orai1 protein positive cells mean optical density value.ResultsThe lung tissue pathological section HE staining showed inflammatory cell infiltration，bronchial mucosal edema，bronchial visible mucus，confirmed the asthma model was established successfully.Compared with the normal control group，the total number of cells，neutrophils count，eosinophils count in BALF sediment of the asthma group were significantly increased，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.The expression of orai1 protein positive cells mean optical density value of asthma group was significantlyhigher than the normal control group（P＜0.05）.Asthma group and normal control grouphad no significant difference in expression the stim1 protein positive cells in the average optical density value（P＞0.05）.ConclusionOrai1 proteins may play an important role in the contraction of asthma rat airway smooth muscle cells.

stim1；orai1；asthma；airway smooth muscle cells

R 562.25

A

1000－1492（2014）04－0430－04

2013－10－28接收

1安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230022

2临沂市人民医院儿科，临沂 276000

王 丽，女，硕士研究生；王亚亭，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangyating1348＠126.com