金黄色葡菌球菌刺激巨噬细胞对JNK活化和Th1/Th2型细胞因子分泌的影响

肖文艳，方 磊，吴惠梅，丁佩山，刘荣玉

◇基础医学研究◇

金黄色葡菌球菌刺激巨噬细胞对JNK活化和Th1/Th2型细胞因子分泌的影响

肖文艳，方 磊，吴惠梅，丁佩山，刘荣玉

目的探讨金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7对c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路活化及其对Th1/Th2型细胞因子表达的影响。方法体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞，以金葡菌的感染复数（MOI）值为10（金葡菌∶细胞＝10∶1）刺激RAW264.7细胞，设置时间点为0.5、1.0、1.5、2.0h。Western blot检测金葡菌刺激后RAW264.7细胞JNK磷酸化水平，ELISA法检测各时间点RAW264.7细胞上清液中白介素-5（IL-5）和干扰素-γ（IFN-γ）的表达水平。结果金葡菌刺激RAW264.7细胞后JNK磷酸化水平显著升高，在0.5h最明显（P＜0.01）；细胞上清液中IFN-γ水平在金葡菌刺激后0.5、1.0h显著升高（P＜0.01），而在1.5、2.0h逐渐恢复到正常水平（P＞0.05）；IL-5水平在金葡菌刺激后1.0h时开始升高（P＜0.05），并在1.5、2.0h显著升高（P＜0.01）；另外IL-5/IFN-γ在1.0、1.5、2.0h时差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论金葡菌刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞能够活化JNK通路，并影响Th1/Th2型细胞因子的表达。

巨噬细胞；JNK；IL-5；IFN-γ

慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等多种肺部疾病的共同病理生理特征，是多种炎性细胞及细胞因子相互作用所致的气道病变，在其病理生理过程中，巨噬细胞起着极其重要的作用。巨噬细胞在细菌毒素、烟雾等有害物质的刺激下，向肺组织迁移并释放多种细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-5、IL-4等，这些细胞因子又可以趋化T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等迁移进而导致气道持续炎症和严重损伤。研究［1］显示金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）细胞壁成分肽聚糖可以通过巨噬细胞表面Toll样受体2（Toll-like receptor2，TLR2）介导活化丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）信号通路，特别是活化JNK信号通路能够促进巨噬细胞吞噬金葡菌等病原体的过程［2］，并且活化的JNK信号通路能够激活下游核转录因子系统释放多种细胞因子。因此，该研究拟通过金葡菌刺激小鼠巨噬细胞来观察JNK信号通路的活化及其对IL-5、INF-γ炎性细胞因子分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料小鼠单核－巨噬细胞系RAW264.7购于中国科学院上海细胞库；金葡菌NCTC8325由中国科学技术大学生命科学学院教授馈赠；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素均购于美国Invitrogen公司；胰蛋白胨、酵母提取物购于英国Oxoid公司；氯霉素购于上海现代哈森药业有限公司；细胞裂解液由50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、0.1% SDS、1%Triton X-100、0.25%脱氧胆酸钠，150 mmol/L氯化钠和1 mmol/L EDTA配制而成，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购于瑞士Roche公司；磷酸化JNK（p-JNK）、JNK多克隆抗体购于美国CST公司；GAPDH单克隆抗体购于上海康成生物公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗购于美国Promega公司；蛋白电泳转移系统购于美国Bio-Rad公司；PVDF膜购于美国Millipore公司；ECL化学发光检测试剂盒购于美国Thermo公司；荧光化学发光成像系统购于上海欧翔科学仪器有限公司；奥林巴斯倒置显微镜IX70购于日本Olmypus公司；IL-5、IFN-γ ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司（IL-5货号：CSB-E04637m；IFN-γ货号：CSBE04578m），IFN-γ试剂盒与IL-5试剂盒检测范围分别为15.60～1 000.00 pg/ml和31.25～2 000.00 pg/ml。

1.2 细胞培养RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，同时添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，5%CO2、37℃培养箱中培养，每2～3 d换液1次，每4～5 d根据细胞生长状态传代1次，保持细胞处于对数生长期生长。

1.3 细菌培养金葡菌在0.1%氯霉素的LB培养基（胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；NaCl 10 g/L）中培养16h后，取对数生长期细菌测定其光密度值（optical density，OD）（OD650＝0.2，约合2×108/ml），用甘油将细菌冻存，－80℃保存。

1.4 金葡菌刺激细胞将对数生长期的RAW264.7细胞按1×105/ml的密度分别接种12孔板，培养过夜。PBS清洗金葡菌3次，用不含抗生素的DMEM培养基重悬并稀释，将浓度调整至细胞∶金葡菌＝1∶10，将金葡菌加入细胞中分别刺激0、0.5、1.0、1.5、2.0h。

1.5 Western blot检测细胞JNK蛋白磷酸化水平

各组细胞处理如1.4所示，收集上述各组细胞用PBS漂洗后，加入预冷的细胞裂解液100 μl，冰上裂解15 min，收集裂解产物，12 000 r/min 4℃离心15 min，将上清液移至新的EP管中，取少量用BCA法测定蛋白质含量，然后加入等体积2×loading buffer混匀，沸水中煮10 min，冷却后－20℃保存。取25 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白分离，再通过转膜将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加相应一抗p-JNK和JNK（1∶2 000）4℃过夜后置于室温1h，TBST洗膜3次，每次15 min，加二抗（1∶2 000）室温放置1h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL化学发光试剂孵育蛋白膜上后放入荧光化学发光成像系统中进行检测，Image J软件分析蛋白条带灰度值。GAPDH作为内参，p-JNK与JNK灰度值的比值代表各组样品p-JNK的相对表达量，同时也反映了JNK的磷酸化水平。

1.6 ELISA测定IL-5和IFN-γ的分泌量收集金葡菌刺激细胞后的培养基，1 500 r/min 4℃离心15 min，留取上清液，－80℃保存待测。用相应ELISA检测试剂盒，按说明书操作规范分别检测细胞上清中IL-5和IFN-γ的含量。

1.7 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以¯±s表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较时采用Bonferroni检验。

2 结果

2.1 金葡菌刺激RAW264.7细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的金葡菌刺激巨噬细胞后，显微镜观察实验组RAW264.7细胞与对照组RAW264.7细胞形态上的差异。金葡菌在感染巨噬细胞后，巨噬细胞开始皱缩变形，并逐渐形成吞噬囊泡进而内吞金葡菌。见图1。

图1 金葡菌刺激RAW264.7细胞 ×20

2.2 金葡菌刺激RAW264.7细胞后对p-JNK蛋白表达量的影响金葡菌刺激RAW264.7细胞后，Western blot检测刺激不同时间段RAW264.7细胞中p-JNK蛋白的表达量。各时间段，金葡菌刺激后RAW264.7细胞的p-JNK蛋白表达量均明显高于未刺激的RAW264.7细胞（P＜0.01），且0.5h组相比其余各组，p-JNK蛋白表达升高的水平最明显（P＜0.01），见图2。

2.3 金葡菌刺激RAW264.7细胞后对IL-5/IFN-γ分泌量的影响金葡菌刺激RAW264.7细胞后，ELISA检测刺激不同时间段RAW264.7细胞上清液中IL-5和IFN-γ的分泌量，金葡菌刺激巨噬细胞后，1.0h实验组与对照组IL-5分泌量差异有统计学意义（P＜0.05），1.5h和2.0h实验组相比于对照组，IL-5分泌量差异有统计学意义（P＜0.01）；0.5h和1.0h实验组与对照组IFN-γ分泌量差异有统计学意义（P＜0.01），并且0.5h实验组分泌量最大（F＝269.064）；对IL-5、IFN-γ的分泌量进行相对比较时发现，随着刺激时间的延长，IL-5与IFN-γ分泌量的比值（IL-5/IFN-γ）逐渐增大，且1.0、1.5和2.0h实验组与0.5h实验组差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 处理不同时间的巨噬细胞分泌IL-5、IFN-γ的表达（n＝5±s）

表1 处理不同时间的巨噬细胞分泌IL-5、IFN-γ的表达（n＝5±s）

与对照组（0h）比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与0.5h比较：＃＃P＜0.01

项目0h0.5h1.0h1.5h2.0h IL-5（pg/ml）20.98±2.3325.41±1.9230.29±3.03*38.16±3.48**50.28±3.69**IFN-γ（pg/ml）14.53±2.2334.04±4.46**25.23±2.60**20.03±2.3416.75±1.94 IL-5/IFN-γ1.45±0.060.75±0.471.20±0.14＃＃1.90±0.10＃＃3.01±0.16＃＃

图2 Western blot法检测金葡菌刺激RAW264.7细胞后对p-JNK蛋白表达量的影响

3 讨论

气道防御屏障中的巨噬细胞介导的天然免疫反应在慢性炎症中起着至关重要的作用，主要通过吞噬病原体和协调炎症反应来调控天然免疫应答从而参与炎症的慢性化。分布于巨噬细胞表面的Toll样受体（TLRs）家族通过识别金葡菌细胞壁的组分如肽聚糖、脂磷壁酸等后介导下游信号分子JNK的活［3］，JNK信号通路被激活后，胞质中的JNK分子移位到细胞核，可以进一步促进核内的转录因子c-Jun氨基末端63及73位的丝氨酸残基磷酸化，激活后的核转录因子系统可以释放多种细胞因子参与调控细胞的迁移、增殖与分化［4］。另外JNK信号通路还可以通过上调吞噬相关基因（如清道夫受体CD36、SR-A）促进巨噬细胞吞噬金葡菌的过程［5］。

本实验结果显示金葡菌刺激小鼠巨噬细胞后，JNK磷酸化水平在30 min达到高峰，与此同时，分泌的IFN-γ水平也达高峰，这与Oltmanns et al［6］研究相一致。随着金葡菌刺激时间的延长，JNK磷酸化水平开始降低并伴有IFN-γ分泌的减少，而在整个刺激过程中IL-5的分泌量表现为逐渐增加的趋势。另外，该研究通过IL-5与IFN-γ分泌程度的相对比较来看，金葡菌感染的早期炎性细胞因子主要以IFN-γ为主，而后期IL-5的分泌则逐渐占据主导的地位，而Masuda et al［7］研究发现肥大细胞通过其表面TLR4识别G－菌细胞壁成分脂多糖后活化JNK信号通路并介导Th2型细胞因子（IL-5、IL-10、IL-13）分泌显著升高，并且IL-5和IL-13能够下调巨噬细胞分泌IL-12、IFN-γ，进而加重气道炎症，而本研究显示巨噬细胞在吞噬金葡菌后同样能够活化JNK信号通路并介导IL-5分泌显著升高。

巨噬细胞吞噬金葡菌后完成抗原提呈作用，辅助性T淋巴细胞（Thelper cells，TH）在抗原提呈细胞作用下开始活化，同时产生IL-2，活化的TH细胞在不同细胞因子环境下向Th1或Th2转化（IL-4、IL-5促进Th2的分化，IL-12、IFN-γ促进Th1的分化）。本研究显示在巨噬细胞吞噬金葡菌的后期以IL-5的分泌为主，据此推测在IL-5微环境下，TH细胞倾向于向Th2的分化。另外IL-5可以招募并诱导嗜酸性粒细胞（eosinophil，Eos）分化，JNK信号通路可能涉及到Eos的招募［8］。

Kim et al［9］发现金葡菌的定植与气道慢性炎症密切相关，金葡菌分泌的超抗原肠毒素具有强大的抗原刺激能力，在极低浓度下即可激活大量的T淋巴细胞，并且金葡菌细胞壁成分－肽聚糖和磷壁酸亦为单核/巨噬细胞和淋巴细胞强有力的刺激原，可诱导TNF-α、IFN-γ、IL-5等炎症介质的大量合成与释放［10］。且近年研究［11］显示金葡菌与哮喘密切相关，其分泌出具有超抗原活性的肠毒素不仅能够调节B、T淋巴细胞功能，还能够激活其他炎性细胞（如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等）。

综上所述，本研究显示金葡菌刺激巨噬细胞后活化JNK信号通路并对炎性细胞因子IL-5、IFN-γ有调控作用，提示JNK信号通路可能参与气道慢性疾病的发生。

［1］ Bhatt K H，Sodhi A，Chakraborty R.Peptidoglycan induced expression of Peroxisome proliferator-activated receptor γ in mouse peritoneal macrophages：Role of ERK and JNK MAP kinases［J］.Cytokine，2012，60（3）：778－86.

［2］ Wang H，Wu Y，Ojcius D M，et al.Leptospiralhemolysins induce proinflammatory cytokines through toll-like receptor 2-and 4-mediated JNK and NF-κB signaling pathways［J］.PLoS One，2012，7（8）：e42266.

［3］ Watanabe I，Ichiki M，Shiratsuchi A，et al.TLR2-mediated survival of Staphylococcus aureus in macrophages：a novel bacterial strategy againsthost innate immunity［J］.J Immunol，2007，178（8）：4917－25.

［4］ Wuyts W A，Vanaudenaerde B M，Dupont L J，et al.Involvement of p38 MAPK，JNK，p42/p44 ERK and NF-kappaB in IL-1betainduced chemokine release inhuman airway smooth muscle cells［J］.Respir Med，2003，97（7）：811－7.

［5］ Doyle S E，O′Connell R M，Miranda G A，et al.Toll-like receptors induce a phagocytic gene program through p38［J］.J Exp Med，2004，199（1）：81－90.

［6］ Oltmanns U，Issa R，Sukkar M B，et al.Role of c-jun N-terminal kinase in the induced release of GM-CSF，RANTES and IL-8 fromhuman airway smooth muscle cells［J］.Br J Pharmacol，2003，139（6）：1228－34.

［7］ Masuda A，Yoshikai Y，Aiba K，et al.Th2 Cytokine production from mast cells is directly induced by lipopolysaccharide and distinctly regulated by c-Jun N-Terminal kinase and p38 pathways［J］.J Immunol，2002，169（7）：3801－10.

［8］ Kampen G T，Stafford S，Adachi T，et al.Eotaxin induces degranulation and chemotaxis of eosinophils through the activation of ERK2 and p38 mitogen-activated protein kinases［J］.Blood，2000，95（6）：1911－7.

［9］ Kim E S，Kim E C，Lee S M，et al.Bacterial yield from quantitative cultures of bronchoalveolar lavage fluid in patients with pneumonia on antimicrobial therapy［J］.Korean J Intern Med，2012，27（2）：156－62.

［10］姚咏明，盛志勇.重视金黄色葡萄球菌脓毒症的研究［J］.中华烧伤杂志，2000，16（2）：75－7.

［11］Bachert C，Zhang N，Patou J，et al.Role of staphylococcal superantigens in upper airway disease［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2008，8（1）：34－8.

Effects of Staphylococcus aureus on the activation of JNK and secretion of Th1/Th2 cytokines in murine macrophage

Xiao Wenyan，Fang Lei，Wu Huimei，et al
（Dept of Pulmonary，Anhui Geriatrics Institute，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects on c-Jun amino-terminal kinase（JNK）expression and Th1/Th2 cytokines secretion from mouse macrophage cell line RAW264.7 stimulated by Staphylococcus aureus（S.aureus）.MethodsRAW264.7 cells were cultured in vitro，then were stimulated by S.aureus at a multiplicity of infection（MOI）of 10（S.aureus∶cells＝10∶1）for 0.5，1.0，1.5 and 2.0h respectively.The protein expression of p-JNK was analyzed by Western blot，the levels of interleukin-5（IL-5）and interferon-γ（IFN-γ）in the supernatants of each group were analyzed by ELISA.ResultsAfter stimulating by S.aureus，the level of JNK phosphorylation was significantly increased and was maximized at 0.5h（P＜0.01）；the level of IFN-γ was significantly increased at 0.5，1.0h（P＜0.01），but back to normal level at 1.5 and 2.0h（P＞0.05）；IL-5 began to increase at 1.0h and 1.5h（P＜0.05），and was significantlyhigher at 2.0h（P＜0.01）；additionally，the ratio of IL-5/IFN-γ was significantly increased at 1.0，1.5 and 2.0h（P＜0.01）.ConclusionS.aureus stimulation activates JNK signaling and regulates the balance of Th1/Th2 cytokines in murine macrophages.

macrophage；c-Jun amino-terminal kinase；interleukin-5；interferon-γ

R 562.2＋5；Q 241；Q 74

A

1000－1492（2014）04－0423－04

2014－02－17接收

国家自然科学基金（编号：81270083、81170030）；安徽省重点实验室计划项目（编号：1206c0805028）；安徽省科技攻关项目（编号：12010402135）

安徽医科大学第一附属医院干部呼吸科，安徽省老年病研究所，合肥 230022

肖文艳，男，硕士研究生；刘荣玉，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：rongyuliu＠gmail.com