大鼠神经干细胞的体外分离培养及分化研究

徐 鹏，宋斾文，章仁杰，刘 超，申才良

大鼠神经干细胞的体外分离培养及分化研究

徐 鹏1，宋斾文1，章仁杰1，刘 超2，申才良1

目的建立新生SD大鼠神经干细胞（NSCs）的分离培养、体外分化、鉴定及体外长期培养的方法，并探讨血清浓度对NSCs分化的影响。方法取新生SD大鼠大脑组织，用无血清培养技术培养NSCs。采用免疫荧光技术对NSCs进行鉴定，检测其巢蛋白（Nestin）表达。用含有不同胎牛血清（FBS）浓度（2%、5%、10%）的DMEM/F-12培养基诱导NSCs分化，分别用神经元特异性微管相关蛋白2（MAP-2）抗体、神经胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体行免疫荧光染色鉴定分化细胞。通过Western blot法检测不同FBS浓度的分化条件下MAP-2与GFAP的表达情况。结果获得大量未分化且悬浮生长的NSCs球，并能分化为神经元和神经胶质细胞。随着血清浓度的增加，各组MAP-2的表达逐渐增加（P＜0.05），GFAP的表达逐渐减少（P＜0.05）。结论应用无血清培养技术可成功在体外培养出具有增殖、自我更新及多潜能分化能力的新生大鼠NSCs，可于含有不同FBS浓度（2%、5%、10%）的分化条件下进一步分化为神经元及神经胶质细胞，含低浓度血清的条件培养基促进NSCs向神经元方向分化，而高浓度血清则有利于NSCs向神经胶质细胞方向分化。

大鼠；神经干细胞；细胞培养；免疫印迹

干细胞是一类可自我复制，同时又具有分化成多种组织细胞潜能的多能细胞。应用干细胞的多向分化潜能，尤其是神经干细胞（neural stem cells，NSCs）这一分布于神经系统的、具有自我更新和多分化潜能的细胞，能生成多种神经细胞，特别是神经元细胞，可有效地修复损伤的脊髓组织，重新建立神经间的连接，治疗脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）。早在1992年Reynolds et al［1］及Richards et al［2］从成年大鼠纹状体及海马中分离出了NSCs，随后又在成年哺乳动物大脑纹状体的室管膜下和海马的颗粒层发现了NSCs聚集区。该实验采用无血清培养法进行大鼠NSCs体外分离培养，动态观察其在体外增殖、分化等一系列细胞形态学变化，同时研究血清浓度对NSCs分化的影响，为细胞移植治疗SCI的过程中如何进一步改善有利于NSCs神经生发的微环境提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物24h内新生SD大鼠幼鼠购于安徽医科大学实验动物中心，雌雄不限，共10只。

1.2 主要试剂DMEM/F12培养基购于美国Gibco公司；B-27购于美国Invitrogen公司；表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibrob last growth factor，bFGF）购于美国PeproTech公司；小鼠抗大鼠巢蛋白（Nestin）单克隆抗体、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体、小鼠抗微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）抗体、FITC标记的山羊抗小鼠IgG购于美国Santa Cruz公司；TRITC标记山羊抗兔IgG、Triton X-100购于北京中杉金桥；南美胎牛血清购于美国HyClone公司；多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）购于美国Sigma公司；即用型正常山羊血清购于武汉博士德公司；青链霉素溶液（100×）、Hoechst 33342、胰蛋白酶细胞消化液、免疫染色一抗稀释液、免疫荧光染色二抗稀释液、抗荧光淬灭封片液（强）购于碧云天公司；BCA蛋白定量试剂盒、ECL显影液试剂盒购于美国Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1 NSCs原代培养 取新生24h内的SD大鼠幼鼠，颈椎脱臼法处死，经75%乙醇溶液浸泡5 min。在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，分离出大脑半球，预冷的无菌生理盐水漂洗3次后用显微镊剥除脑膜及血块［3］。将组织块移入另一干净无菌培养皿中，加入1 ml生理盐水，然后用眼科剪将脑组织切碎，形成约1 mm3组织小块，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶细胞消化液，置于37℃细胞培养箱中消化10 min，移液枪轻轻吹打混匀细胞至不见组织碎片，经200目筛网过滤形成单细胞悬液，以600 r/min离心5 min后弃上清液，加入2 ml无血清培养基（DMEM/F-12＋2%B-27＋20 ng/ml EGF＋20 ng/ml bFGF＋青霉素100 U/ml＋链霉素0.1 mg/ml）再次600 r/min离心5 min，弃上清液，加入无血清培养基重悬，计数，以105/ml接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d半量换液1次，约1周传代1次。

1.3.2 NSCs传代培养 培养2～3 d后，逐渐有细胞球形成，呈悬浮生长，1周后，600 r/min离心5 min后吸弃旧培养基，加入新鲜培养基，用吸管轻柔吹打细胞球成为小细胞球和单细胞悬液，按量将细胞悬液分别接种到新培养瓶中，1×105个细胞/瓶，每7 d传代1次，每3 d离心更换半量培养基1次，培养条件不变。

1.3.3 NSCs分化 取第2代培养7 d的细胞球，经600 r/min离心5 min后，吸弃旧的无血清培养基，分别加入去除EGF、bFGF且含有不同FBS浓度（2%、5%、10%）的新鲜培养基（DMEM/F-12＋2% B-27＋青霉素100 U/ml＋链霉素0.1 mg/ml）重悬后，接种于放有0.1 mg/ml多聚赖氨酸包被处理盖玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养，每3 d半量换液，7 d后行免疫荧光染色鉴定。

1.3.4 NSCs及分化后的免疫荧光鉴定 第2代培养7 d的细胞球，接种于有0.1 mg/ml多聚赖氨酸包被处理盖玻片的6孔板中，置于37℃培养箱6h，用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛常温下固定20 min，吸去多余残液后用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次5 min，后在含0.1%TritonX-100的PBS液中孵育20 min，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清工作液后置于37℃培养箱内孵育1h，加入Nestin一抗（1∶50），4℃条件下孵育过夜，次日常温下放置2h，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1∶100），37℃细胞培养箱内避光孵育1h，PBS漂洗3次，每次5 min，最后加入终浓度为10 μg/ml Hoechst溶液避光状态下行细胞核染色5 min，PBS漂洗3次晾干后，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜观察及照相。

细胞球贴壁培养7 d后，取神经胶质细胞和神经元的特异性标志物GFAP、MAP-2行免疫荧光染色。重复以上步骤，MAP-2、GFAP一抗（1∶50）混合稀释后加入各培养孔内，添加二抗FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1∶100）及TRITC标记山羊抗兔IgG（1∶100），荧光显微镜观察及照相。

1.3.5 Western blot检测NSCs分化前后Nestin、MAP-2、GFAP蛋白的表达 提取NSCs分化前及不同分化条件下分化后细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度选择上样量，依次行电泳、转膜、封闭，加一抗于4℃孵育过夜，次日洗膜，加入相应二抗，室温孵育2h，充分洗涤后ECL化学发光显影并行胶片显影定影处理。所使用抗体及稀释度：Nestin（鼠单抗，1∶500稀释），MAP-2（鼠单抗，1∶200稀释），GFAP（兔多抗，1∶500稀释），β-actin（鼠单抗，1∶1 000稀释），二抗（山羊抗小鼠，1∶5 000稀释；山羊抗兔，1∶5 000稀释）。胶片扫描后采用Image J软件分析各组条带的灰度值。

1.4 统计学处理应用SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，检验水平α＝0.05。

2 结果

2.1 原代细胞培养原代细胞接种后，在显微镜下观察为悬浮的单个圆形细胞，边界清楚，折光性强。接种2～3 d后，部分细胞死亡，单个细胞减少，大多数细胞分裂成小的细胞球，由单个细胞增殖形成。随着时间的推移，细胞球的大小及数量明显增大、增多，到第7天时培养瓶内生长出数十个甚至上百个细胞的集落，多呈球形、桑葚状，折光性强，未见到明显的细胞突起，部分细胞球因体积过大出现细胞球中心颜色暗淡、透光性较差。见图1。

2.2 NSCs鉴定培养的细胞球贴壁6h后，于显微镜下观察，部分细胞球外周细胞已伸出小突起，部分形态上已发生改变，行NSCs特异性Nestin抗体免疫荧光染色，结果显示原代培养形成的细胞球中大部分细胞表达Nestin阳性。见图1、2。

2.3 NSCs分化鉴定培养过程中，观察到NSCs球逐渐贴壁，6h后已有部分细胞分化为具有1～2个短状突起的神经元样细胞，部分分化为具有多个长突起并呈梭样排列的神经胶质样细胞并随着培养时间的延长，突起逐渐变长、增多，与相邻的细胞构成网状结构，至分化培养第7天，显微镜下可见各细胞球分化后向四周放射状生长，排列紧密，各细胞间覆盖。免疫荧光染色结果可见GFAP阳性的神经胶质细胞及MAP-2阳性的神经元细胞。提示所培养原代细胞具有多分化潜能，为NSCs，可分化为神经元及神经胶质细胞。见图1、2。

图1 NSCs原代培养及分化

图2 NSCs及分化后的免疫荧光鉴定

2.4 NSCs分化前后Nestin、MAP-2、GFAP蛋白的表达NSCs组Nestin蛋白明显表达，2%FBS、5% FBS、10%FBS 3组未检测出Nestin蛋白的表达。各组间MAP-2蛋白表达差异有统计学意义（F＝80.440，P＜0.05），两两比较显示，NSCs组MAP-2蛋白的表达显著低于2%FBS组、5%FBS组、10% FBS组（P＜0.05）；与5%FBS组和10%FBS组相比较，2%FBS组的MAP-2表达显著增加（P＜ 0.05）；5%FBS组的MAP-2表达较10%FBS组明显增加（P＜0.05）。各组间GFAP蛋白表达差异有统计学意义（F＝580.018，P＜0.05），两两比较显示，NSCs组GFAP蛋白的表达显著低于2%FBS组、5%FBS组、10%FBS组（P＜0.05）；与5%FBS组和10%FBS组相比较，2%FBS组的GFAP表达显著减少（P＜0.05）；10%FBS组的GFAP表达较5%FBS组明显增加（P＜0.05）。见图3。

图3 Western blot检测NSCs分化前后各组Nestin、MAP-2、GFAP蛋白的表达水平

3 讨论

在NSCs治疗SCI的相关研究中，移植外源性NSCs一直是主要的研究手段，此类方法多是通过促进移植到SCI部位的NSCs有效地向神经元分化，促进其神经生发，从而形成彼此间的神经通路，促进脊髓重建及神经修复的作用［4］。NSCs在移植到SCI区域后可分化为神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞，桥接脊髓断端并重建脊髓传导通路，改善损伤平面以下的运动及感觉功能［5－6］。有研究［7－8］表明，将NSCs体外分化为胶质细胞后移植，可促进脊髓区空洞的修复，而将NSCs诱导分化为少突胶质细胞后移植到SCI区域，可有效促进损伤区脱髓鞘神经的髓鞘化，但是有实验研究［9］显示：移植到脊髓中的NSCs最终绝大部分分化成为星型胶质细胞形成瘢痕，神经生发的比例较低，进一步阻碍了SCI区域神经通路的建立。由此可见，如何正确处理NSCs体内移植后的分化问题是解决NSCs治疗SCI的关键。

Nestin是一种中间丝蛋白，又称之为细胞骨架蛋白，该蛋白在多潜能的神经外胚层细胞表达，但Nestin并非只在NSCs中表达，肌肉和胰岛细胞中也有相应的表达，因此并不能将其作为高特异性的表面标志物来单独鉴定NSCs［10］。一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞时，Nestin停止表达，神经元和神经胶质细胞分别表达其特异性蛋白：MAP-2、GFAP。

在本实验过程中，采用了去除bFGF、EGF且含有不同FBS浓度（2%、5%、10%）的DMEM/F-12培养基诱导NSCs分化，免疫荧光染色示Nestin表达（＋）的细胞球贴壁分化后含有GFAP表达（＋）的神经胶质细胞及MAP-2表达（＋）的神经元。这间接显示了之前聚集形成的细胞球是由能够自主分化形成神经胶质细胞及神经元的NSCs组成，同时在NSCs的分化过程中，随着血清浓度的增加，MAP-2蛋白表达量逐渐减少，GFAP蛋白表达量逐渐增多。这也直接表明血清浓度的高低决定NSCs的分化情况，低浓度血清的条件培养基促进NSCs更多地向神经元方向分化，而高浓度血清则有利于NSCs向神经胶质细胞方向分化。

目前在NSCs的原代培养及增殖分化方面的研究已经取得一定进展，在本次体外实验中，可以通过调整条件培养基中血清含量的高低来影响NSCs分化的结果，以提高神经元所占分化后细胞中的比例，但对于体内实验中NSCs的具体定位、迁移分化过程及其规律仍缺乏全面的认识。如何更好地解决NSCs移植后的定向分化问题仍是提高NSCs移植疗效所必须面对的难题。

［1］ Reynolds B A，Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system［J］.Science，1992，255（5052）：1707－10.

［2］ Richards L J，Kilpatrick T J，Bartlett P F.De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89（18）：8591－5.

［3］ 刘 萍，涂 彧.表皮生长因子在新生大鼠神经干细胞培养中的作用［J］.苏州大学学报（医学版），2010，30（2）：310－2.

［4］ Kan E M，Ling E A，Lu J.Stem cell therapy for spinal cord injury［J］.Curr Med Chem，2010，17（36）：4492－510.

［5］ Tarasenko Y I，Gao J，Nie L，et al.Human fetal neural stem cells grafted into contusion-injured rat spinal cords improve behavior［J］.J Neurosci Res，2007，85（1）：47－57.

［6］ Du C，Yang D，Zhang P，et al.Single neural progenitor cells derived from EGFP expressing mice is useful after spinal cord injury in mice［J］.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol，2007，35（4）：405－14.

［7］ Nakamura M，Okada S，Toyama Y，et al.Role of IL-6 in spinal cord injury in a mouse model［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2005，28（3）：197－204.

［8］ Gao J，Coggeshall R E，Tarasenko Y I，et al.Human neural stem cell-derived cholinergic neurons innervate muscle in motoneuron deficient adult rats［J］.Neuroscience，2005，131（2）：257－62.

［9］ Pluchino S，Cusimano M，Bacigaluppi M，et al.Remodelling the injured CNS through the establishment of atypical ectopic perivascular neural stem cell niches［J］.Arch Ital Biol，2010，148（2）：173－83.

［10］张 蕾，李晓莉.神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养［J］.中国现代医学杂志，2012，22（20）：52－5.

Isolation，cultivation in vitro and differentiation of rat neural stem cells

Xu Peng，Song Peiwen，Zhang Renjie，et al
（Dept of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo establish the isolation，differentiation，identification and long-term cultivation in vitro of the neural stem cells（NSCs）from neonatal SD rats，and to investigate the effect of the serum concentration on the differentiation of NSCs.MethodsBrain tissue was isolated from neonatal SD rats and NSCs were cultured in serum free medium.To identify NSCs and detect Nestin expression in NSCs by immunofluorescence.In the condition of DMEM/F-12 containing different concentrations（2%，5%，10%）of FBS to induct the differentiation of NSCs，to identify the differentiated cells with the antibodies of neuron specific microtubule-associated protein 2（MAP-2）and glial cell specific glial fibrillary acidic protein（GFAP）by immunofluorescence.In the differentiation conditionscontaining different concentrations of FBS，to detect the expression of MAP-2 and GFAP by Western blot.ResultsA mass of undifferentiated neurospheres were obtained and cultured in suspension，those NSCs could differentiate into neurons and astrocytes.With increasing serum concentrations，the expression of MAP-2 in each group gradually increased（P＜0.05），and the expression of GFAP gradually decreased（P＜0.05）.ConclusionWe successfully obtain the fetal rat NSCs in vitro，whichhave the capacities of proliferation，self-renew and pluripotentiality with the application of serum free cultivation.In the differentiation conditions containing different concentrations（2%，5%，10%）of FBS，NSCs differentiate into neurons and glial cells，the conditioned medium containing low concentration of serum promote the differentiation of NSCs into neurons，thehigh concentration of serum is conducive to the differentiation of NSCs into neural glial cells.

rat；neural stem cell；cell culture；Western blot

R 651.2

A

1000－1492（2014）04－0443－05

2014－02－17接收

1安徽医科大学第一附属医院骨科，合肥 230022

2安徽医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，组织工程干细胞研究所，合肥 230032

徐 鹏，男，硕士研究生；申才良，男，副教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：shencailiang1616＠163.com