二黄汤对哮喘模型大鼠肺组织中TGF-β1及体内IL-33的影响

聂艳辉 霍博雅 孙会珍

二黄汤对哮喘模型大鼠肺组织中TGF-β1及体内IL-33的影响

聂艳辉1霍博雅2孙会珍2

目的 观察二黄汤对哮喘模型大鼠肺组织中转化生长因子β1(TGF-β1)及体内白介素-33(IL-33)的影响。方法50只SD大鼠随机均分为正常组、哮喘组、布地奈德组、高剂量二黄汤组（含生药量68 g/kg）和低剂量二黄汤组（含生药量17 g/kg）。以卵清白蛋白致敏与激发建立哮喘大鼠模型，随后分别用布地奈德、二黄汤干预治疗。肺组织切片HE染色观察病理变化并检测气道管壁厚度（Wat）及气道平滑肌厚度（Wam），用免疫组化法检测肺组织TGF-β1蛋白的表达，酶联免疫法检测血清及支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-33的含量。结果所有药物干预组较哮喘组炎症细胞浸润明显减轻；布地奈德组、高剂量二黄汤组和低剂量二黄汤组Wat均较哮喘组下降（μm2/μm: 54.99±8.82、52.28±7.61、58.53±7.63 vs 79.50±5.64，P＜0.05）；布地奈德组、高剂量二黄汤组和低剂量二黄汤组Wam均较哮喘组下降（μm2/μm:22.74±2.73、20.63±1.72、21.20±4.50 vs 30.16±1.68，P＜0.05）；与正常组比较，哮喘组BALF、血清中IL-33的浓度增高，经药物干预后，布地奈德组、高剂量二黄汤组和低剂量二黄汤组低于哮喘组（P＜0.05），但3干预组间差异无统计学意义；哮喘组TGF-β1高于正常组（IOD:12.60±2.25 vs 1.67±0.17），布地奈德组（5.51±2.48）、高剂量二黄汤组（5.22±2.52）和低剂量二黄汤组（6.92±2.18）均低于哮喘组（P＜0.05），3干预组间差异无统计学意义。哮喘大鼠的气道壁厚度和平滑肌厚度与TGF-β1、IL-33呈正相关。结论二黄汤可在一定程度上干预哮喘大鼠气道重塑，其作用可能是通过调节TGF-β1和IL-33实现的。

哮喘；气道重塑；二黄汤；转化生长因子-β1；白细胞介素-33

支气管哮喘(哮喘)是以气道高反应性和不可逆性气道重塑为特点的气道慢性炎症性疾病[1]。参与哮喘的细胞因子很多，转化生长因子β1(TGF-β1)通过促进气道平滑肌细胞的增殖参与气道重塑,而白细胞介素-33(IL-33)能够介导哮喘的气道炎症，在哮喘的发病机制中发挥着重要的促炎效应[2]。中医治疗哮喘有着丰富的临床经验。本研究通过复制慢性哮喘大鼠模型，观察二黄汤对哮喘肺组织中TGF-β1及体内IL-33的影响，为哮喘的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂及仪器 6周龄SD大鼠50只，雌雄各25只，体质量（160±20）g，购自辽宁医学院实验动物中心。卵清白蛋白(OVA)购自美国Sigma公司；布地奈德气雾剂购自阿斯利康公司；TGF-β1多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB试剂盒、IL-33酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；二黄汤由黄芩和黄芪组成，水煎并浓缩成含生药量68 g/kg和17 g/kg的混悬液。双目镜显微镜（日本Olympus公司）；JWC-201D超声雾化器（辽宁鞍山市同信医用仪器厂）；XD711酶标仪（上海迅达医疗仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将50只大鼠按随机数表法分为5组：正常组、哮喘组、布地奈德组、高剂量二黄汤组（68 g/kg）及低剂量二黄汤组(17 g/kg)，每组10只，雌雄各5只。

1.2.2 哮喘动物模型的复制 参照文献[3-5]复制哮喘大鼠模型，适应性饲养1周后，在第1、8天腹腔注射10%的OVA生理盐水混悬液1 mL[内含OVA100 mg、Al(OH)3100 mg]致敏，于实验第15天始将大鼠置于密闭容器内，予1%OVA生理盐水溶液雾化激发，1 mL/min，30 min/次，1次/d，在雾化激发前30 min，高、低剂量二黄汤组分别以质量浓度为68 g/ kg、17 g/kg的二黄汤灌胃（2 mL/只）；布地奈德组生理盐水等体积灌胃及布地奈德0.25 mg/kg雾化吸入；哮喘组、正常组等体积生理盐水灌胃及雾化。均连续处理6周。以大鼠呼吸急促、口唇发绀、点头呼吸、皮毛无光泽，肺部有哮鸣音、站立不稳等表现为模型建立成功的标志。

1.2.3 标本采集及处理 各组大鼠均于末次激发后24 h内取材。腹腔麻醉下，心脏穿刺取血，行左侧支气管肺泡灌洗。将支气管肺泡灌洗液（BALF）和血液一起离心（3 000 r/ min)10 min后，分别收集上清液置入无菌EP管储存于-20℃冰箱。同时取右肺中下叶肺组织标本置于4%多聚甲醛固定至少48 h后，进行脱水、透明、石蜡包埋、切片、片厚4 μm，用于组织病理学及免疫组化检测。

1.2.4 支气管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam)的测定 石蜡切片进行常规HE染色，观察病理学改变。每组随机取8张切片，在光镜下，每张切片选取3个完整无斜切的小支气管横截面，参照文献[6]关于气道各层的定义，采用Image-propls图像分析系统测定各支气管基底膜周长(Pbm)、支气管总面积(Wat1)、管腔面积(Wat2)、平滑肌外缘内气管面积(Wam1)、平滑肌内缘内气管面积(Wam2)，并用Pbm标准化以消除管径大小、气道形态以及切片方向不同等所造成的差别,即以(Watl-Wat2)/Pbm和(Waml-Wam2)/Pbm来表示Wat和Wam。

1.2.5 血清及BALF中IL-33浓度的测定 应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测血清及BLAF中IL-33的浓度，实验过程参照试剂说明书进行，根据系列稀释的12 pg/L、8 pg/L、4 pg/L、2 pg/L、1 pg/L标准品浓度，应用酶标仪450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值，并计算出IL-33的浓度值。

1.2.6 免疫组化测定TGF-β1蛋白表达水平 采用SABC法按试剂盒说明书测定TGF-β1表达水平，用高压热抗原修复，各组分别滴加1∶400的一抗，阴性对照以PBS代替一抗，其余条件相同。染色判断标准：阴性为不着色，弱阳性呈淡黄色，阳性呈黄色，强阳性呈棕黄色和棕色。每张切片任意选择3个高倍镜下(×400)支气管视野，分别以选定气管为中心，应用Image-propls图像分析软件测定整张切片阳性部位的平均吸光度（IOD）用以代表阳性部位的蛋白表达水平，每组计算24个IOD值的平均值作为该组的IOD值。

1.3 统计学方法 全部数据经SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，相关性分析采用Pearson直线相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由于造模死亡及取材失败，每组取8只大鼠标本检测。

2.1 肺组织病理改变 正常组肺组织结构的各级支气管上皮组织完整，肺泡间隔及腔内无明显炎症细胞浸润。哮喘组气道上皮细胞脱落，黏膜下及管周有大量的炎细胞浸润，以淋巴细胞和嗜酸性粒细胞为主，肺泡腔内炎性渗出，气道壁及气道平滑肌明显增厚、肥大，黏膜下层增宽，黏膜上皮增生，管腔狭窄等。布地奈德组和高、低剂量二黄汤干预组上述改变较哮喘组明显减轻，但未完全消失，见图1。

2.2 各组Wat和Wam结果比较 哮喘组的Wat和Wam均高于正常组，经干预后，布地奈德组、高剂量二黄汤组、低剂量二黄汤组Wat和Wam均较哮喘组降低，但均高于正常组（均P＜0.05），布地奈德组、高剂量二黄汤组、低剂量二黄汤组之间差异无统计学意义，见表1。

2.3 血清及BALF中IL-33含量的比较 哮喘组血清及BALF中IL-33的含量均高于正常组，经干预后，布地奈德组、高剂量二黄汤组、低剂量二黄汤组血清及BALF中IL-33的含量均低于哮喘组，但仍高于正常组（P＜0.05），布地奈德组、高剂量二黄汤组、低剂量二黄汤组BALF中IL-33的含量差异无统计学意义，布地奈德组、高剂量二黄汤组血清中IL-33的含量差异无统计学意义，但低剂量二黄汤组血清中IL-33的含量高于布地奈德组（P＜0.05），见表2。

Table 1 Wat and Wam in each group表1 各组Wat和Wam比较 （n=8±s）

＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与哮喘组比较，P＜0.05

组别正常组哮喘组布地奈德组高剂量二黄汤组低剂量二黄汤组F Wam(μm2/μm) 14.94±1.87 30.16±1.68a22.74±2.73ab20.63±1.72ab21.20±4.50ab12.64＊＊细支气管（支）24 24 24 24 24 Wat(μm2/μm) 37.81±1.25 79.50±5.64a54.99±8.82ab52.28±7.61ab58.53±7.63ab29.41＊＊

2.4 各组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达水平比较 哮喘组支气管上皮细胞、黏膜下、气管平滑肌层、成纤维细胞及炎性细胞等广泛表达TGF-β1，强表达为棕黄色，对照组表达不明显，见图2。哮喘组TGF-β1蛋白表达水平高于正常组，干预后均低于哮喘组，但仍高于正常组（均P＜0.05），布地奈德组、高剂量二黄汤组、低剂量二黄汤组间差异无统计学意义，见表2。

2.5 相关性分析 气道壁厚度、平滑肌厚度与TGF-β1蛋白表达呈正相（r分别为0.725、0.857，P＜0.01）,与血清和BALF中IL-33的含量也呈正相关（r分别为0.760、0.751，P＜0.01）。

Table 2 Serum IL-33 concentration,BALF and TGF-β1 expression in lung tissues in each group表2各组血清及BALF中IL-33含量和肺组织中TGF-β1水平比较 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与哮喘组比较，c与布地奈德组比较，P＜0.05

组别正常组哮喘组布地奈德组高剂量二黄汤组低剂量二黄汤组F n 8 8 8 8 8 IL-33（pg/L）BALF 1.53±0.27 5.99±0.43a3.02±0.99ab3.22±0.94ab3.70±0.89ab23.18＊＊血清2.95±0.11 6.01±0.69a4.28±0.43ab4.25±0.38ab4.98±0.78abc18.53＊＊TGF-β1（IOD）1.67±0.17 12.60±2.25a5.51±2.48ab5.22±2.52ab6.92±2.18ab44.71＊＊

3 讨论

气道炎症和气道重塑是支气管哮喘的两个主要病理特征。气道炎症是炎症细胞、细胞因子及炎症介质相互作用的结果。气道重塑的特征性病理改变主要表现为气道平滑肌增生和肥大、细胞外基质(ECM)沉积、上皮下纤维化、基底膜增厚、血管生成和黏液腺体的增生等。两者的关系尚有争议，普遍被接受的是慢性炎症可能继发气道重塑，而气道重塑也可能与炎症同时被激发。

气道平滑肌增厚是气道重塑的一个重要特征。在肺组织中，几乎所有的结构细胞和炎症细胞都能表达和分泌TGF-β1，而TGF-β1又可作用于这些细胞及炎症介质，参与哮喘的发生、发展。TGF-β1不仅可以诱导气道平滑肌细胞的增殖还可以加强其迁移。在血小板生长因子存在的情况下，TGF-β1可上调平滑肌细胞中基质金属蛋白和金属蛋白抑制剂的表达，加强其向上皮组织的迁移而形成新的肌束[1]，进而使平滑肌和气道壁增厚。现代药理学研究，黄芪、黄芪提取物[7-8]和黄芩及黄芩提取物[9]可干预哮喘气道炎症和气道重塑。糖皮质激素是当前控制哮喘最有效的药物。故本研究以布地奈德作为阳性对照药物，观察黄芩及黄芪组成的复方二黄汤对哮喘模型大鼠的作用，结果发现使用二黄汤干预后，哮喘大鼠支气管壁厚度和平滑肌厚度较哮喘模型组显著下降，但与布地奈德组无差异，提示二黄汤可在一定程度改善气道重塑。而对于TGF-β1在肺组织的表达，二黄汤组和布地奈德组无差异，提示二黄汤对于TGF-β1具有良好的抑制作用，二黄汤可能通过抑制TGF-β1的表达参与改善气道重塑，且在这过程中无明显剂量依赖关系。

气道炎症仍是目前哮喘研究的重点。IL-33是近年发现的IL-1家族的成员，也是一种新的触发炎症免疫反应的细胞因子。有报道IL-33参与Th1/ Th2细胞炎症过程[10]，而Th1/Th2比例失衡是哮喘免疫-炎症机制中重要的因素。嗜酸性粒细胞是哮喘时IL-33的主要炎症细胞分泌来源[11]。本研究肺组织病理学结果显示：哮喘组气道黏膜下及管周有大量的炎细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，肺泡腔内也有炎性渗出，经布地奈德和高、低剂量二黄汤干预后，炎症反应减轻，其途径可能是通过降低哮喘大鼠体内的IL-33来实现，且高、低剂量二黄汤和布地奈德一样可以降低哮喘模型大鼠血清和BLAF中IL-33的含量，疗效无差异，无明显剂量依赖关系。相关性分析结果显示气道壁厚度、平滑肌厚度与TGF-β1蛋白表达及IL-33呈正相关，提示二黄汤抑制哮喘气道重塑可能与其抑制慢性气道炎症密切相关，抑制气道炎症可能有利于改善气道重塑。

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(2013-09-11收稿 2013-11-12修回)

（本文编辑 闫娟）

The Effect of Erhuang Decoction on Transforming Growth Factor-β1of Lung Tissues and the Expression of Leukotriene-33 in Asthmatic Rats

NIE Yanhui1,HUO Boya2,SUN Huizhen2
1Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University

Objective To investigate the effect of Erhuang decoction on TGF-β1expression of lung tiusses and the concentrations of IL-33 in asthmatic rats.MethodsFifty Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups equally:Control group,Asthmatic group,Budesonide aerosol group,High-dose Erhuang decoction group(68 g/kg)and Lowdose Erhuang decoction group(17 g/kg).The model of asthma was established by ovalbumin(OVA)sensitizing and challenging.Then Erhuang decoction and budesonide aerosol was used respectively for intervention therapy.Histologic HE staining were used to observe the general pathologic alteration and to analyze the total bronchial wall area(Wat)and the muscle wall area(Wam).The protein expressions of TGF-β1in the lung tissues were detected by immunohistochemistry.The concentrations serum IL-33 and BALF were tested by sandwich ELISA.ResultsThere was significant reduction in the infiltrated inflammatory cells in all drug intervention groups compared with asthma group;The Wat and Wam in asthmatic group was significantly higher in than those in Budesonide aerosol group，High-dose Erhuang decoction group and Low-dose Erhuang decoction group(Wat μm2/μm:54.99±8.82,52.28±7.61,58.53±7.63 vs 79.50±5.64,P＜0.05;Wam μm2/μm:22.74±2.73, 20.63±1.72,21.20±4.50 vs 30.16±1.68,P＜0.05);Compared with control group,BALF and serum IL-33 concentration were significantly higher in asthmatic group.Compared with asthmatic group,all the indicators were significantly decrease in the treatment groups after drug intervention(P＜0.05).Andthere was no significant difference between the treatment groups in all the indicators.TGF-β1expression in lung tissues in asthmatic group were significantly higher than that in control group (12.60±2.25 vs 1.67±0.17).Compared with asthmatic group,there was significantly reduction of TGF-β1expression in the Budesonide aerosol group(5.51±2.48),High-dose Erhuang decoction group(5.22±2.52)and Low-dose Erhuang decoction group(6.92±2.18)(P＜0.05).There were no significant difference between the treatment groups.TGF-β1expression and serum IL-33 concentration in asthmatic rats were positively correlated with Wat and Wam.ConclusionThe effects of Erhuang decotion on ameliorating the progression of airway remodeling about asthmatic rats may be partially by regulating TGF-β1 and IL-33.

asthma;airway remodeling;erhuang decoction;transforming growth factor-β1;leukotriene-3

R562.25,R285

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.014

1辽宁锦州，辽宁医学院（邮编121000）；2辽宁医学院附属第三医院中医科