育真熄风汤对帕金森病模型小鼠脑内铁蛋白Fn的影响＊

秦博文，党晓伟，卢思英，商亚珍

（1.承德护理职业学院科研处，河北承德 067000；2.承德医学院，河北承德 067000）

1924年，Lehermitte等发现帕金森病（PD）患者脑内铁含量增加显著，存在异常堆积的现象。PD患者黑质内铁异常沉积的原因不明，但越来越多的证据显示铁在脑黑质部位的异常沉积与PD密切相关，极有可能是PD发病的一个重要因素［1］。铁在脑内主要以Fn蛋白的形式储存，正常情况下，当细胞内增多的铁离子水平高于细胞代谢所需时，就会诱导Fn合成，这样游离铁就可以结合在铁蛋白核内，以一种可利用的无毒形式存在，如果铁蛋白的合成正常进行，黑质中增加的铁就会是无毒性状态［2］，Fn可以防止细胞内过剩的自由铁离子的堆积，被认为是天然的铁螯合剂，Fn蛋白越高对PD患者疗效越好。本研究通过探讨育真熄风汤（YZXFT）对脑内Fn蛋白表达作用，为进一步研究其治疗PD的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性C57／BL小鼠90只，SPF级，6～7周龄，体质量（18±2）g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，小鼠饲养于承德医学院动物实验中心，室温维持在（18±2）℃，湿度维持在50%±10%，昼夜循环光照条件下，自由进食和饮水，实验开始前适应环境1周。

1.2 仪器与试剂 Leica石蜡切片机（德国），恒温摊片烤片机（TK-218，湖北），Thermo石蜡包埋机（英国），Olympus显微镜及摄像装置（BH-2型，日本），HI98127酸度计（意大利），水域振荡器（SZX-B，哈尔滨），恒温磁力搅拌器（江苏），美多巴（每片含左旋多巴200mg＋苄丝肼50mg，上海罗氏），1-甲基-4-苯基-1，20，3，6-四氢吡啶（MPTP，美国Sigma），兔抗小鼠 TH 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），Ferritin heavy chain（H-53）：sc-25617（Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 YZXFT（含生黄芪15g，熟地30g，龟板30 g，怀牛膝15g，白芍20g，鹿角胶12g，附子3g，补骨脂12g，天南星12g，白芥子12g，天麻15g，牡蛎30g，枳壳10g，丹参30g，酒大黄6g，全蝎8g，蜈蚣2g，条僵蚕12g），生药总量275g，根据药理学方法计算小鼠给药量，按照每次小鼠灌胃10 mL／kg计算，3个中药治疗组分为低、中、高剂量组，小鼠给予相当于生药量分别为35.75、71.50、143.00g／kg的药液，阳性对照药物美多巴（每片250mg），采用CMC溶解配制成浓度为12.5mg／mL的溶液，造模药MPTP采用生理盐水配制成浓度为0.33%的溶液。

1.2.2 PD小鼠模型 建立参照 Nobutaka Arai，Kazuaki Misugi的实验方法，略加修改。小鼠造模前训练小鼠自上而下完成爬杆运动1min，以确保小鼠能顺利完成实验项目。训练时间为每日上、下午每只小鼠各完成爬杆活动3次，连续5d。造模前1d，采用爬杆实验筛选健康灵活小鼠，选用能在6～10s内完成爬杆的小鼠，消除小鼠的运动差异，造模采用生理盐水配制的0.33%MPTP（30mg·kg－1·d－1）腹腔注射，连续5d。

1.2.3 动物分组与给药 将小鼠分成6组，每组15只，实验药物采用灌胃法给药，按照10mL／kg的剂量给予小鼠灌胃，从首次注射MPTP前3d开始，灌胃小鼠（中药治疗组）分别给予高（143g／kg）、中（71.5g／kg）、低 （35.75g／kg）浓度 的YZXFT，美多巴组给予阳性药物美多巴悬液（125mg·kg－1·d－1）灌胃，以上统称（治疗组）；空白对照组和模型对照组给予生理盐水灌胃，造模期间及造模后持续灌胃给药共27d。

1.2.4 行为学检测 取一长50cm，直径1cm的木制杆垂直竖立，顶端固定一直径1.5cm的黏土小球，为防止打滑，木杆表面缠一层纱布。将被测小鼠头向下放到小球上，从小鼠接触小球开始计时，到小鼠前爪着地为止，记录小鼠从小球爬下木杆所用时间。如遇小鼠中途停止或反向爬行结果不计，重新测试。如小鼠抱杆停留，不能爬行，或不能抓杆，直接掉落计120 s。每只小鼠每天在同一时间测试3次，以连续爬行用时最短的2次作为有效，取平均值作为小鼠最终爬杆时间。

1.2.5 标本采集 分别于造模第6、13、20、27天分批处死小鼠取材。用10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠，麻醉成功后，打开胸腔，插管经左心室插入升主动脉，经插管快速注入37℃生理盐水灌流液冲洗，同时剪开右心耳放血，直到流出液不见血色，肝脏发白为止。再用推注10%福尔马林溶液灌注，直至小鼠头和四肢僵硬，灌注完毕后迅速断头，剥离颅骨及软脑膜，取出脑，置于10%福尔马林固定液中继续固定，24h后0.1mol／L的PBS（pH＝7.2）液浸泡6h中止固定。经脱水，常规石蜡包埋，灌状连续切片，片厚5μm，隔100μm取1，用于免疫组织化学染色。

1.2.6 免疫组织化学（SABC法） 切片常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，95%、90%、80%、70%乙醇依次浸没10min，纯水浸洗5min×2次；PBS浸泡5 min×2次），3%H2O237℃恒温箱孵育30min灭活内源性酶；枸橼酸盐修复液微波煮沸修复，冷却至37℃；5%BSA羊血清封闭；一抗分别用1∶150兔抗小鼠TH抗体，1∶200Ferritin heavy chain（H-53），4℃过夜；生物素化山羊抗兔IgG抗体（Ⅱ抗）和SABC，37℃各孵育20min；DAB显色，苏木素复染2min，HCL-ALC分化1～2s；脱水、透明、封片，阴性对照以PBS代替一抗进行染色。结果判定：以胞质内出现棕黄色颗粒为阳性神经元。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间多样本均值间比较采用单因素方差检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 行为学测试 小鼠在注射MPTP 5～10min后，出现肢体震颤、弓背、竖毛竖尾、后肢伸张及跳窜等动作，持续20～30 min后，小鼠活动明显减少，动作迟缓，对外界反应降低，逃避反应迟钝，甚至匍匐不动，此情况持续一段时间后逐渐恢复，24 h后完全消失。爬杆实验采用小鼠完成固定爬杆的时间来评估小鼠的运动协调能力，见表1。

表1 实验各组爬杆标准计分比较（n＝15，±s，分）

表1 实验各组爬杆标准计分比较（n＝15，±s，分）

△：P＜0.05，△△：P＜0.01，与空白对照组比较；＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，与模型对照组比较。

组别 当天6.40±1.35 7.07±1.16 6.93±1.98 6.80±2.04模型对照组 6.33±1.67 19.20±5.40△△ 54.73±17.03△△ 76.28±27.65△△YZXFT低剂量组 6.47±1.55 21.20±6.33 44.00±20.81 62.14±18.37＊YZXFT中剂量组 6.80±1.74 22.73±9.49 41.67±24＊＊ 59.15±19.45＊＊YZXFT高剂量组 6.47±1.85 20.40±4.27 36.13±19.77＊ 53.29±12.28＊美多巴组 6.73±1.39 18.80±4.39 39.13±12.87＊ 50.94±14.80 1d 3d 5d空白对照组＊＊

表2 各组小鼠脑内Fn蛋白表达比较（n＝3，±s）

表2 各组小鼠脑内Fn蛋白表达比较（n＝3，±s）

△：P＜0.05，△△：P＜0.01，与空白对照组比较；＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，与模型对照组比较。－：表示此项无数据。

组别 剂量9 0.019 2±0.001 7模型对照组 － 0.018 3±0.000 3△△ 0.012 5±0.001 3△△ 0.019 9±0.000 7△△ 0.019 9±0.000 0 YZXFT低剂量组 35.75g／kg 0.018 8±0.001 0 0.014 1±0.000 1 0.023 6±0.001 7 0.014 3±0.001 7＊＊YZXFT中剂量组 71.50g／kg 0.040 3±0.001 9＊＊ 0.034 8±0.000 4＊＊ 0.024 6±0.003 2 0.028 6±0.000 1＊＊YZXFT高剂量组 143.00g／kg 0.099 1±0.001 8＊＊ 0.077 1±0.002 5＊＊ 0.095 2±0.009 2＊＊ 0.053 7±0.003 2＊＊美多巴组 125.00mg／kg 0.083 7±0.007 9＊＊ 0.089 1±0.001 4＊＊ 0.140 1±0.002 3＊＊ 0.065 5±0.001 8 6d 13d 20d 27d空白对照组 － 0.005 7±0.000 4 0.005 8±0.000 2 0.012 6±0.001＊＊

图1 实验第27天黑质内Fn免疫组织化学蛋白表达（SABC法，×400）

结果显示，首次注射MPTP前1d，各组小鼠均在6～10s内完成爬杆活动，注射MPTP后，模型对照组与空白对照组比较，完成爬杆时间出现延长，且完成爬杆时间随着用药时间的延长而显著增加，尤其从第3天开始，差异有统计学意义（P＜0.05），中药组与模型对照组比较，爬杆时间有所缩短。

2.2 Fn组化染色 Fn阳性细胞染色为棕黄色，为神经胶质细胞，空白对照组小鼠脑内胞质着色均匀分布，神经细胞胞体正常，轮廓饱满，核仁清晰，模型对照组与空白对照组比较，模型对照组神经胶质细胞数量明显降低，治疗组神经胶质细胞较模型对照组增多，体积较饱满，结构较清晰，见图1。

2.3 YZXFT对小鼠脑内Fn蛋白表达的影响 Fn免疫组织化学结果显示，在给药的第6、13、20天模型组Fn含量与空白组比较增加，差异均有统计学差异（P＜0.05），分别为2.21倍、1.15倍、0.36倍。给药的第6、13、20和27天，YZXFT 低剂量组与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＜0.05）；YZXFT中剂量组与模型对照组比较，Fn蛋白表达分别增加了1.20倍（P＜0.01）、1.78倍（P＞0.05）、95.2%（P＞0.05）、48.95%（P＜0.01）；YZXFT高剂量组与模型对照组比较，Fn蛋白表达分别增加了4.41、5.16、6.55、1.79倍，差异均有统计学意义（P＜0.01）；而美多巴组与模型对照组比较，Fn蛋白表达分别增加了3.57、6.12、10.19、2.41倍，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表2。

3 讨 论

YZXFT以熟地、龟板、鹿角胶为君药，辅以其他滋肝阴、补肾气、补脾益气、活血化瘀、化疾通络的中药有效成分，从多靶点、多层次、多途径整体调节机体功能，达到熄风止痉、引血下行、肾阳充盛，肝阳下潜，虚风得熄，筋脉得养，抽搐震颤自止的效果，符合PD的中医治疗理论。行为学上采用爬杆实验［3－4］作为测试小鼠协调运动能力改变的指标，结果显示在造模第3天，模型对照组与空白对照组的出现显著差异，随着MPTP注射时间的增加，每次注射后小鼠的运动障碍程度较前1d增加，症状持续时间相应延长。中药治疗组和美多巴组与模型对照组比较PD小鼠运动协调障碍均有不同程度的减轻，恢复时间有所缩短，显示YZXFT可减轻PD小鼠的行为学障碍，实验结果表明，本次研究所采用的连续5d腹腔注射MPTP（30mg·kg－1·d－1）建立的PD小鼠模型是可靠的，并且YZXFT对MPTP所致小鼠运动协调能力障碍具有一定的改善作用。

多数学者普遍认为，铁通过Fenton反应与H2O2反应产生具有高度活性的羟自由基（-OH），-OH通过作用于核酸、蛋白质和含有大量不饱和脂肪酸的细胞膜，从而引起细胞损伤［5］。结合的Fe3＋需要被还原成Fe2＋后才能与H2O2反应生成-OH，这是铁产生氧化应激损伤的一个关键环节。铁在脑内主要以Fn的形式储存，Fn是由蛋白质外壳和壳内无机复合体的铁核构成。蛋白质外壳是由重链（H亚基）和轻链（L亚基）组成。H亚基含有有活性的铁氧化酶，它是氧化Fe2＋的关键酶［6］。SN内铁以Fe2＋的形式被摄取，随之在铁蛋白外壳被铁氧化酶氧化为Fe3＋并转入铁核，以多聚体形式聚集在铁核内，而L亚基不含有铁氧化酶。因此H亚基具有迅速结合和稳定铁，减少氧化应激损伤的作用，被认为是细胞抗氧化损伤的天然保护剂。同样，铁蛋白中的Fe3＋也可以在多种生物还原剂如半胱氨酸、还原型核黄素和抗坏血酸的作用下还原成Fe2＋而释放［7］。正常情况下，当细胞内增多的Fe2＋水平高于细胞代谢所需时，就会诱导Fn合成，这样游离铁就可以结合在铁蛋白核内，以一种可利用的无毒形式存在。如果铁蛋白的合成正常进行，SN中增加的铁就会是无毒性状态［8］，Fn可以防止细胞内过剩的自由铁离子的堆积，因此，被认为是天然的铁螯合剂。

本研究结果显示，模型对照组比空白对照组Fn显著增加，可能是游离铁的增加诱发铁蛋白合成增多。而治疗组小鼠Fn水平较模型组增多显著，且随着剂量的增加，Fn水平也增加，YZXFT高剂量组与美多巴组近似，提示YZXFT可能是通过促进胶质细胞内铁蛋白含量的增加，进而结合游离铁离子，降低铁的异常堆积，对抗神经细胞膜上产生的脂质过氧化反应，从而保护黑质多巴胺神经元免遭氧化应激的攻击，达到抗PD的目的。

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