Nutlin-3a诱导p73α对p53突变型结肠癌细胞的作用及其机制研究

邬黎青，詹 媛，王 莉，陈 玲，陈小青，杨 洋，高 歌，郝 华

Nutlin-3a是近几年发现的MDM2小分子拮抗剂，能结合到MDM2上的 p53位点，阻止MDM2与p53结合，稳定内源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制细胞生长，引起细胞凋亡。在p53缺失或p53基因突变的癌细胞中，Nutlin-3a能阻止MDM2与p73α结合，增加内源性p73α的转录活性[5-6]，同时p73α能激活p53应答基因，从而抑制细胞生长，引起细胞凋亡。以前认为低量的p53引起细胞静止，而高量的p53导致细胞老化或凋亡[7]。然而2010年有研究显示，低浓度Nutlin-3a诱导p53低表达，导致细胞老化；而高浓度Nutlin-3a诱导p53高表达，导致癌细胞死亡(凋亡及有丝分裂死亡)的同时，又把部分癌细胞阻滞在静止期，这些静止期的细胞撤药后能恢复进入细胞周期，进行生长增殖[8-9],这限制了Nutlin-3a的治疗作用。肿瘤中p53基因突变很常见，而p73α基因突变却罕见[10]。对于p53基因突变的肿瘤，Nutlin-3a不能诱导其内源性p53的产生，但可通过诱导p73α来达到治疗肿瘤的目的。 Nutlin-3a抑制含野生型p53基因的结肠癌细胞生长的研究已有发表[11]，但Nutlin-3a对p53基因突变的结肠癌细胞的作用尚未见报道。 本课题研究Nutlin-3a对p53突变型结肠癌细胞株Coca-2的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂、细胞株和细胞培养 Nutlin-3a〔Sigma，溶解于二甲基亚砜(DMSO)，10 mmol/L小试剂瓶分装，-20 ℃保存〕； DMEM高糖液体培养基及胎牛血清购自Hyclone公司；p73α及p21抗体购自美国Abcom公司； MTT试剂盒、β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色试剂盒购自碧云天生物技术公司。人体结肠癌细胞株Caco-2(上海中科院细胞库)，用10%胎牛血清DMEM培养基培养于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃潮湿环境中。

1.2 MTT实验 收集并调整细胞悬液浓度至合适浓度，每孔加入200 μl接种至96孔板，培养24 h后吸弃上清，实验设8组(对照组及不同浓度Nutlin-3a组)，每组设6个复孔，分别加入0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μmol/L的Nutlin-3a培养液200 μl，分别培养24、48、72 h。避光条件下进行如下操作：弃去旧培养基，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2遍，加入新培养基200 μl后，每孔再加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，细胞培养箱中继续孵育4 h，弃去旧培养基，每孔加入150 μl DMSO,使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪于570 mm波长处测量各孔的吸光度(OD570 nm)。根据吸光度计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=(1-实验组OD570 nm/对照组OD570 nm)×100%。

1.3 Western blotting法 将Caco-2细胞接种于35 mm培养皿(调整细胞数为3×105个/皿)；24 h后用不同浓度Nutlin-3a培养液培养Caco-2细胞；72 h后倒掉培养液，Western blotting法检测p73α及p21蛋白表达。最后行光密度分析：通过Gel．Pro analyzer图像分析系统读取目的条带在X光胶片测得的光密度值，以各组β-actin条带的扫描值标化其蛋白表达量。

1.4 衰老相关β-Gal染色 β-Gal聚集在老化细胞的溶酶体中，在老化细胞中高表达，被作为老化细胞的生物标志物。β-Gal染色是以X-Gal为底物，X-Gal经糖β-Gal切割后生成蓝绿色的沉积产物，该产物在显微镜下容易被观察到而用来探测和鉴别衰老细胞。将Caco-2细胞接种于35 mm培养皿；24 h后用不同浓度Nutlin-3a培养液培养Caco-2细胞；72 h后按照衰老相关β-Gal染色试剂盒说明书进行β-Gal染色实验。

1.5 细胞集落形成分析 将Caco-2细胞接种于35 mm培养皿(调整细胞数为3×105个/皿)；24 h后用不同浓度Nutlin-3a培养液培养Caco-2细胞；72 h后用PBS清洗细胞3次，然后用新鲜培养基培养细胞。72 h后，显微镜下观察细胞是否增生，细胞微集落是否形成；继续用新鲜培养基培养72 h，PBS清洗后，进行结晶紫染色，显微镜下观察细胞集落(>50个细胞/集落)的形成。

2 结果

2.1 对照组及不同浓度Nutlin-3a组不同时间吸光度及细胞生长抑制率比较 对照组及不同浓度Nutlin-3a组不同时间吸光度及细胞生长抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；Nutlin-3a浓度与处理时间存在交互作用(P<0.05)；对照组及不同浓度Nutlin-3a组吸光度及细胞生长抑制率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同时间间差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1 Comparison of absorbance value and cell inhibition rate between control group and Nutlin-3a groups with different concentrations and among different times

组别吸光度24h 48h 72h细胞生长抑制率(%)24h 48h 72h对照组0 72±0 081 15±0 060 76±0 05---2 5μmol/L组0 51±0 030 71±0 050 59±0 0328 61±1 4938 11±0 9738 46±1 305 0μmol/L组0 42±0 140 69±0 090 45±0 0841 84±0 2240 29±1 3253 01±1 0610 0μmol/L组0 37±0 100 35±0 130 18±0 0151 27±1 3169 19±1 5281 08±1 0220 0μmol/L组0 26±0 040 18±0 110 14±0 0363 73±1 0184 07±1 8485 55±1 3440 0μmol/L组0 17±0 030 13±0 040 08±0 0177 02±0 7188 68±0 5391 68±0 8660 0μmol/L组0 12±0 060 09±0 050 07±0 0282 87±0 3291 99±0 8695 01±0 6280 0μmol/L组0 10±0 020 06±0 010 05±0 0185 65±0 6594 68±0 2097 40±0 51F值F交互=4 65，F组间=21 29，F时间=68 59F交互=8 92，F组间=19 67，F时间=20 49P值P交互=0 026，P组间<0 001，P时间<0 001P交互<0 001，P组间<0 001，P时间<0 001

注：-为无此项

2.2 对照组及不同浓度 Nutlin-3a组p73α及p21蛋白表达比较 对照组及不同浓度 Nutlin-3a组p73α及p21蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中2.5 μmol/L组、5.0 μmol/L组、10.0 μmol/L组、20.0 μmol/L组、40.0 μmol/L组、60.0 μmol/L组、80.0 μmol/L组p73α蛋白表达高于对照组，10.0 μmol/L组、20.0 μmol/L组、40.0 μmol/L组、60.0 μmol/L组、80.0 μmol/L组p73α蛋白表达高于2.5 μmol/L组，20.0 μmol/L组、40.0 μmol/L组、60.0 μmol/L组、80.0 μmol/L组p73α蛋白表达高于5.0 μmol/L组，60.0 μmol/L组和80.0 μmol/L组p73α蛋白表达高于10.0 μmol/L组，80.0 μmol/L组p73α蛋白表达高于20.0 μmol/L组和40.0 μmol/L组，差异均有统计学意义(P<0.05)；40.0 μmol/L组、60.0 μmol/L组、80.0 μmol/L组p21蛋白表达高于对照组，60.0 μmol/L组和80.0 μmol/L组p21蛋白表达高于2.5 μmol/L组和5.0 μmol/L组，80.0 μmol/L组p21蛋白表达高于10.0 μmol/L组和20.0 μmol/L组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

Table2 Comparison of levels of p73α and p21 protein between control group and Nutlin-3a groups with different concentrations

组别p73αp21对照组1 23±0 111 02±0 082 5μmol/L组2 75±0 26∗1 75±0 465 0μmol/L组3 15±0 35∗1 86±0 6110 0μmol/L组4 36±0 16∗△2 44±0 3720 0μmol/L组4 83±0 34∗△▲2 56±0 6840 0μmol/L组5 06±0 46∗△▲3 43±0 56∗60 0μmol/L组5 56±0 63∗△▲☆4 09±0 46∗△▲80 0μmol/L组6 56±0 35∗△▲☆★●4 65±0 51∗△▲☆★F值65 7618 72P值<0 001<0 001

注：与对照组比较，*P<0.05；与2.5 μmol/L组比较，△P<0.05；与5.0 μmol/L组比较，▲P<0.05；与10.0μmol/L组比较，☆P<0.05；与20.0 μmol/L组比较，★P<0.05；与40.0 μmol/L组比较，●P<0.05

图1 对照组及不同浓度 Nutlin-3a组p73α及p21蛋白表达

Figure1 The expression of P73α and P21 protein in control group and Nutlin-3a groups with different concentrations

2.3 β-Gal染色结果 Nutlin-3a浓度为2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L时可导致Caco-2细胞老化，细胞呈现大而扁平的老化形态学改变，老化细胞β-Gal染色呈蓝绿色；当Nutlin-3a浓度为40.0、60.0、80.0 μmol/L时，大量细胞坏死，残存的细胞体积变小，呈现出细胞静止的形态学改变，衰老相关β-Gal染色阴性(见图2)。

2.4 细胞集落形成分析结果 对照组及不同浓度Nutlin-3a组不同时间Caco-2细胞数量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；Nutlin-3a浓度与处理时间存在交互作用(P<0.05)；对照组及不同浓度Nutlin-3a组Caco-2细胞数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同时间间差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table3 Comparison of Caco-2 cell count of control group and Nutlin-3a groups with different concentrations in different time points

组别处理72h撤药72h撤药144h对照组172324±4361189357±3461242184±38152 5μmol/L组144578±2461164553±2876198672±29435 0μmol/L组112645±3618125678±3176126646±196310 0μmol/L组78642± 56887562± 61190432± 53420 0μmol/L组45614± 24951468± 29169623± 34940 0μmol/L组15568± 34955646± 315106158± 38160 0μmol/L组11837± 24852424± 169101238± 21780 0μmol/L组10229± 17948123± 23497623± 496F值F交互=18 10，F组间=4 26，F时间=5 78P值P交互<0 001，P组间<0 001，P时间=0 017

图2 对照组及不同浓度 Nutlin-3a组β-Gal染色结果

3 讨论

研究表明Nutlin-3a在含野生型p53的各种癌症治疗中有效,而在突变型p53中无效[12]。Nutlin-3a通过结合到MDM2的 p53位点，阻断MDM2与p53结合，抑制MDM2对p53的降解，稳定内源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制细胞生长并引起细胞凋亡。50%以上的肿瘤中p53基因发生突变，而p73α基因突变却罕见。MDM2与p73α结合后，不能降解p73α，但能抑制p73α的转录活性，使细胞内p73蛋白含量减少[13]。 p73α结合在MDM2的N-端疏水基团上，这也是Nutlin-3a的结合部位。Nutlin-3a结合此部位后，阻断了p73α与MDM2的结合，从而解除MDM2对p73α的抑制作用。本研究结果显示，含突变型p53基因的结肠癌Caco-2细胞经Nutlin-3a处理后，Nutlin-3a浓度增高，p73α及p21蛋白表达也有所增加。p73α基因是p53基因的家族成员，具有与p53相似的功能，在抑制肿瘤的发生中有重要作用。人p73 基因有α、β、γ、δ和 ε等多个同源异构体，是由于p73转录时不同地剪接及利用不同的启动子进行转录造成的，其不同在于N-及C-末端。p73α是全长p73，由 636个氨基酸组成，其C-末端的142个氨基酸是其独有的。p73α基因的结构类似于p53基因，具有p53基因相似的功能基团及相似的生物活性[14]，能激活p53应答基因如p21、Bax、Puma和Noxa等而抑制细胞生长，引起细胞凋亡[15-16]。其中，p21是强有力的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，能使细胞停滞在G1期，不进入S期，从而抑制细胞增生。p73α的增高会引起凋亡相关蛋白Bax、Puma及Noxa的增高，故细胞凋亡增加，残存的细胞减少。此外，p21亦能介导细胞老化，在许多细胞中，过度表达p21均能引起细胞老化，而敲除p21则能延缓细胞老化。细胞老化是指细胞生长发生G1/S期阻滞，不可逆地丧失增殖潜能、具有大而扁平的形态特征、表达特征性生物标记β-Gal。

本研究结果显示，2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a诱导p21蛋白表达量较低，引起较多细胞老化，而40.0～80.0 μmol/L的Nutlin-3a所诱导的p21蛋白表达量较高，使残存的细胞呈静止状态，这似乎与上述p21的作用相反。其实，除p21外，细胞的状态受多种蛋白的影响。细胞对静止期及老化期的选择还部分取决于丝/苏氨酸激酶mTOR(mammalian target of rapamycin)的活性。当mTOR活性被p53及p73靶基因TSC2(tuberous sclerosis 2)抑制时，细胞进入静止期；当mTOR活性未被抑制或未被完全抑制时，细胞进入老化期。高浓度Nutlin-3a诱导较高量的p53通过激活其靶基因TSC2而抑制mTOR活性，使细胞进入静止期[17]。TSC2为p73的靶基因，尽管本研究未检测TSC2的表达(将在下一步的实验中检测)，但可推测2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a诱导p73α蛋白表达量较低，其靶基因TSC2的蛋白表达量也较低，不能完全抑制mTOR的活性，细胞进入老化期。40.0～80.0 μmol/L的Nutlin-3a诱导p73α蛋白表达量较高，产生的TSC2较高，完全抑制mTOR活性，细胞进入静止期。静止期的细胞在药物撤除后恢复增生能力，使肿瘤复发。

综上所述，Nutlin-3a通过阻断MDM2与p73α的结合，解除MDM2对p73α的抑制作用，使p53基因突变型Caco-2结肠癌细胞中的p73α活性增强，以致p73α及其下游靶基因p21、Bax、Puma等的蛋白表达增强，而抑制癌细胞生长、引起细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。高浓度的Nutlin-3a引起肿瘤细胞显著诱导死亡，但因诱导大量的 TSC2完全抑制mTOR的活性，使残存的癌细胞处于静止期，药物撤除后恢复生长，肿瘤复发。因此，使用Nutlin-3a治疗肿瘤时，考虑其对肿瘤细胞抑制及杀伤作用的同时，应当考虑到其对残存细胞细胞周期的影响，只有在使用适当的药物浓度避免静止期细胞残存时才能对肿瘤起到根治作用。本研究表明在体外2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a对p53突变型结肠癌的治疗作用最为理想。

本课题人员贡献：邬黎青与詹媛共同设计了本研究并共同完成Western blotting部分的实验及整理结果并撰写论文，为本研究做了等同的贡献。王莉及陈玲共同完成了细胞培养及MTT实验以及所有的统计学分析。陈小青及杨洋完成了衰老相关β-Gal染色实验。高歌及郝华完成了细胞集落形成实验。

本文创新点：

(1)检测Nutlin-3a对p53基因突变的结肠癌细胞株Caco-2的作用。

(2)发现2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a能明显抑制Caco-2细胞，撤药后残存的细胞再生不明显；残存的细胞处于老化期；这个浓度范围的Nutlin-3a是体外治疗p53基因突变的结肠癌的最佳浓度。

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