爱罗咳喘宁对慢性阻塞性肺疾病大鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-8和白细胞介素-18及炎细胞的影响❋

谢文英，尚立芝△,张良芝,常学辉,胡文豪

(1．河南中医学院，郑州 450008; 2．河南省中医院，郑州 450008)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonarydisease,COPD)是常见的以气道不完全可逆性阻塞为特征的慢性炎症性疾病，由多种炎症细胞及炎症介质参与所致。其患病率随年龄的增长而增加，是中国人群的主要致死病因之一[1]。COPD 主要临床表现为咳嗽、咳痰等呼吸道症状，属于中医“咳嗽”、“痰饮”、“喘证”等范畴。本课题组自拟爱罗咳喘宁方，经多年临床和前期动物实验显示，爱罗咳喘宁能显著提高COPD患者和动物模型的肺功能，改善肺组织结构，但其作用机制不明[2～7]。本研究制备脂多糖(LPS) 加烟雾诱导COPD大鼠模型，观察爱罗咳喘宁对COPD大鼠BALF 和血浆中参与炎症反应的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素-8 (interleukin-1，IL-8 ) 和IL-18及炎细胞的影响，探讨爱罗咳喘宁对COPD的作用机制。

1 材料

1.1 药物与动物

爱罗咳喘宁方药物组成:炙麻黄6 g,苦杏仁10 g,茯苓15 g,半夏10 g,葶苈子10 g,苍术10 g,干姜6 g,麦芽20 g,白术12 g,山药15 g,党参15 g,芫花6 g等,以上药物由河南中医学院第一附属医院制剂室制成口服液,真空包装,每支100 ml,含生药100 g。6月龄雄性清洁级SD大鼠50只，体质量300±20 g，由河南省实验动物中心提供(HNLA-2010-111)。

1.2 试剂与仪器

检测大鼠TNF-α(H052)、IL-8(H008)和IL-18(H015) ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。自制动物熏箱(50 cm×50 cm×40 cm)、18号静脉套管针(马来西亚制造)、脂多糖(LPS，Sigma 公司)、红旗渠牌香烟(烤烟型,焦油含量14 mg/支,尼古丁含量1.1 mg/支，河南安阳卷烟厂)。FA/JA电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、TGL-16GA低温高速离心机(上海安亭仪器厂)、VIS-7220型分光光度仪(北京第二光学仪器厂)、U-CMAD3型OLYMPUS显微镜(日本Olympus公司)、FAME16/30F全自动酶标议(瑞士哈美顿公司)等。

2 方法

2.1 动物分组与模型制备

大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、爱罗咳喘宁口服液低、中、高剂量组(5，10，20 mL·kg-1·d-1)，每组10只。参照文献[8,9]制备脂多糖(LPS) 烟雾诱导COPD大鼠模型。采用气管注LPS加熏香烟方法：在第1天和第14天用1%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将18号静脉套管针快速插入气管，拔出针芯，用1 mL注射器注入溶于生理盐水的LPS200 μL(1 mg/mL)，然后将大鼠固定板直立旋转，使LPS能够均匀分布于两肺。第2～28天(第14天除外)将大鼠置入熏箱内熏香烟烟雾40 min/次，每天2次(每次8支烟)，每周休息1 d；正常组第1天、第14天经气管注入200 μL生理盐水，其余无特殊处理。

2.2 给药方案

模型制备成功后，参考文献[10]正常组、模型组灌胃给予蒸馏水(10 mL·kg-1·d-1)，各治疗组大鼠给予爱罗咳喘宁口服液低、中、高剂量组分别灌胃混悬液(5、10、20 mL·kg-1·d-1，每毫升含爱罗咳喘宁口服液生药0.75 g，连续7 d。

2.3 取材、标本制作与检测

[11,12]和试剂盒说明书进行操作，ELISA法用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠血浆和BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18浓度。

2.3.1 血浆TNF-α、IL-8和 IL-18 第7天给药结束后，10%水合氯醛(0. 3 ml/100 g) 腹腔麻醉，剖腹抽取腹主动脉血，离心取血清放入-20℃冰箱内待测。

2.3.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)的制备、炎细胞计数及分类 采血后断头处死大鼠，开胸暴露气管和肺门，结扎右主支气管。用套管针穿刺至左肺，以生理盐水2 ml×3次行肺泡灌洗，回收率约80%，BALF存入硅塑管内静置1 h。原液行细胞计数后，取1 mlBALF以2000 r/min离心5 min，取上清液置入EP管，保存于-20 ℃ 冰箱中待检。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠BALF中炎细胞计数和分类比较

表1显示，与正常组比较，模型组BALF中炎细胞总数和中性粒细胞数均显著增高(均P< 0.01)。与模型组比较，爱罗咳喘宁低、中、高剂量组BALF中炎细胞计数、中性粒细胞和巨噬细胞数显著减少(P<0.05或P<0.01)。

3.2 爱罗咳喘宁对COPD大鼠血浆TNF-α、IL-8和IL-18 含量的影响

表2显示，与正常对照组比较，模型组血浆TNF-α、IL-8和IL-18含量均显著升高(均P<0.05)；与模型组比较，爱罗咳喘宁口服液中剂量组TNF-α、IL-8和IL-18含量均显著降低(均P<0.05)。

3.3 爱罗咳喘宁对COPD大鼠 BALF中TNF-α、IL-8和IL-18含量的影响

表3显示，模型组 BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18都显著高于正常组(均P<0.05)；与模型组比较，爱罗咳喘宁低、中、高剂量组中TNF-α、IL-8和IL-18都显著降低(均P<0.05)。

表1 各组COPD大鼠BALF中炎症细胞计数和分类比较

注：与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；N-中性粒细胞，M-巨噬细胞

表2 爱罗咳喘宁对各组COPD大鼠血浆IL-8、TNF-α含量的影响

注：与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01(下表同)

表3 爱罗咳喘宁各组COPD大鼠 BALF 中 IL-8 和 TNF-α 含量的影响

3.4 COPD模型组大鼠血浆和BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18含量的相关性

应用非参数Spearman等级相关分析, 对TNF-α与IL-8含量的相关性进行分析, 结果显示，在模型组中血浆TNF-α与IL-8呈正相关(rs=0.631,P=0.010)， BALF 中TNF-α与IL-8含量亦呈正相关(rs=0.783,P=0.000)。

4 讨论

COPD的发病机制目前不清。研究表明，吸入有害物质引起气道与肺的持续炎症是COPD发病的关键。在COPD患者的气道、肺实质和肺血管中均存在着巨噬细胞、嗜酸细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞增加，导致肺实质破坏，引起气道狭窄。本研究结果显示，模型组BALF中炎细胞总数和中性粒细胞数均显著高于正常组(均P<0.01)，与文献报道相近[13]，提示中性粒细胞的支气管肺组织浸润起重要作用。与模型组比较，爱罗咳喘宁低、中、高剂量组BALF中炎细胞计数、中性粒细胞和巨噬细胞数显著低于模型组(P<0.05或P<0.01)，提示爱罗咳喘宁通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞数增加起抗炎作用。

COPD气道与肺实质的持续炎症涉及炎症细胞及其释放的炎症介质。烟雾中的粉尘、细菌等进入气道，刺激呼吸道上皮细胞产生炎性介质，TNF-α升高是COPD病情加重的一个重要指标，它可使IL-8转录因子NF-kB激活。香烟烟雾中的颗粒物质被巨噬细胞吞噬后，促进TNF-α、IL-8和IL-18的释放[14]。IL-8起炎症促进作用，并刺激中性粒细胞黏附于血管内皮，渗出并释放中性粒细胞酶如蛋白酶、弹性酶等溶解细胞外基质，进而炎细胞浸润，诱发炎症反应和肺组织损伤[15]。

COPD的临床表现属于中医“咳嗽”、“痰饮”、“喘证”等范畴，中医认为其病因病机为六淫之邪侵袭入体，卫表受邪，肺失肃降，痰浊滋生，或他邪犯肺，或他脏腑累及于肺。本病其标在肺，其本在脾、肾。爱罗咳喘宁为自拟方药，由炙麻黄、苦杏仁、云苓、苍术、半夏、葶苈子、干姜、麦芽、白术、山药、党参、芫花、赤芍等药物组成。方中炙麻黄辛散而微兼苦降之性，可使肺气宣畅，以复肺司肃降、平喘之要药，配伍杏仁祛痰止咳平喘，两者同为君药；臣以半夏燥湿化痰，葶苈子泻肺降气、祛痰平喘；干姜温肺化饮，茯苓健脾化痰，芫花泻水逐饮、祛痰止咳；佐以党参健脾益肺，白术健脾益气，山药补脾、养肺、固肾、益精，苍术燥湿健脾，麦芽健脾和胃，赤芍活血祛瘀，全方可起健脾祛痰、止咳平喘之效[4，5]。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组血浆和BALF中TNF-α、IL-8和IL-18水平均显著增高，提示TNF-α、IL-8和IL-18共同参与 COPD 炎症反应。与模型组比较，爱罗咳喘宁中剂量组大鼠血浆和BALF 中 IL-8、IL-18与TNF-α水平显著低于模型组(均P<0.05)，提示爱罗咳喘宁可减低血浆和 BALF 中 TNF-α、IL-8、IL-18 水平，具有抑制 TNF-α、IL-8和IL-18合成与释放，从而发挥其抗炎作用，可能是爱罗咳喘宁口服液治疗COPD的作用机制之一。

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