颈康片对退变颈椎间盘髓核超微结构影响的实验研究❋

林石明,李兆文,陈鲁峰,林俊山,赵学田,王瑞国,林向前,陈联源,许书亮,周琳英

(1.福建省漳州市中医院,漳州 363000;2.福建中医学院骨伤系,福州 350003；3.福建医科大学电镜室,福州 350003)

颈椎病是由于颈椎间盘退变、突出、节段性不稳定、骨质增生或骨赘形成等原因在椎管内或椎间孔处刺激和压迫脊髓、颈神经根、椎动脉等组织，导致患者出现颈部疼痛、肩臂手麻木、头痛、眩晕甚至瘫痪等症状，其中神经根型颈椎病是发病率最高的1种类型，约占60%～70%，好发于中老年人，多见于40～60岁人群，严重影响患者的日常生活与工作。对于该病的治疗，目前西医大多采用非甾体抗炎药止痛和营养神经等对症治疗，远期疗效欠佳，且由于止痛药对胃肠的副作用，一部分患者无法耐受。颈椎病属于中医学“痹证”范畴，采用中医药治疗取得一定疗效，且没有毒副作用。我院根据老中医验方颈痛宁研制而成颈康片，用于治疗神经根型颈椎病10余年取得显著疗效，并未发现毒副作用[1]。我们经过系列实验研究[2～4]证实，该药使用安全，具有抗炎镇痛、改善微循环作用，同时对颈椎间盘髓核炎症介质能够起到干预作用。由于神经根型颈椎病的发病基础是颈椎间盘退行性改变所致，故本实验采用透射电镜从细胞水平及亚细胞水平观察颈康片对退变颈椎间盘髓核超微结构的影响，以初步探讨该药的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6个月龄新西兰兔28只，雌雄各半，体质量2.5～3.0 kg，由浙江省实验动物中心提供(实验动物合格证书号96(001)号)，医学实验动物环境设施为兔类实验室清洁级(合格证书号医动学第 98(001)号)。

1.2 实验药物

颈康片(闽药制字Z06602035)原药材由漳州市医药公司统一购进，由漳州市中医院制药厂负责加工制备，1 ml含生药3.6 g(批号001009)；颈复康由承德中药集团有限责任公司提供(批号080193)。

1.3 实验仪器

透射电镜，Hu-12A型,日本产;医用X线诊断机，300 mA 国产(北京);Olympus 万能显微镜，BH-2型,日本产;石蜡切片机，CUT4060型,德国产。

1.4 动物造模、分组、给药、取材

1.4.1 分组及造模 28只6月龄新西兰兔雌雄各半，适应性喂养1周后，按随机数字表法分成模型组20只，正常对照组8只。编号后分笼饲养，自由摄食饮水，喂以标准颗粒饲料，保持饲养房湿度60%～80%，湿度适宜24 ℃～28 ℃，通风良好，采光条件可。

造模方法参照文献[4～6]进行，模型组用盐酸氯胺酮肌注麻醉(0.1 g/kg)后，取俯卧位于手术桌上，颈部剪毛消毒后，取颈部后正中切口，自枕外粗隆至胸1，长约8～10 cm，逐层切开皮肤、皮下组织，找出项韧带将其切除，自椎板往两侧剥离椎旁肌肉，将其部分切断，然后将颈椎棘间韧带切断，仔细止血后，观察无活动性出血点，逐层缝合。术后肌注庆大霉素1次预防感染(4万U/只)。1周后伤口愈合，即将模型组新西兰兔关进特制低头位兔笼中，每天2次，每次2 h，持续8周。术后8周，模型组及正常对照组各处死2只新西兰兔，然后将模型组分为颈康片组、颈复康组及生理盐水组，每组6只。

1.4.2 给药及取材 术后8周，颈康片组及颈复康组开始给药，用药剂量按《动物体表面积比率换算等剂量法》，由正常人每日常用剂量换算得出。颈康片组给药量为3.6 g/kg·d，颈复康组给药量为4.0 g/kg·d，给药前选用生理盐水将颈康片浸膏配成0.36 g/ml溶液，颈复康冲剂配成0.4g/ml溶液，采用灌胃法给药每天1次，按10 ml/kg·d喂食药物；而生理盐水组及正常对照组分别按10 ml/kg·d灌服生理盐水，连续喂食4周。

术后4、8周后进行颈椎拍片检查，术后8周模型组及正常对照组各处死2只新西兰兔，取颈4-5椎间盘髓核组织进行显微镜观察。给药4周后处死全部新西兰兔，取出颈4-5椎间盘髓核，每组取2个颈4-5髓核，经固定、切片等处理后进行透射电镜观察。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 颈椎X线摄片检查 正常对照组与模型组新西兰兔均于术后4周、8周采用盐酸氯胺酮肌注麻醉后拍摄颈椎侧位X线片。

1.5.2 透射电镜观察髓核超微结构 取颈4-5椎间盘髓核约1mm3，经过前固定、漂洗、后固定、系列脱水、包埋、染色及切片后上铜网，于日立Hμ-12A电子显微镜下观察软骨细胞、胶原纤维超微结构。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 X线片检查结果

各组新西兰兔均于术后4周及术后8周在同样摄片条件下拍摄颈椎侧位X线片(图1～4所示)，参照余氏评分法[3]观察椎间孔缩小程度、生理弧度改变、椎间隙是否变窄、椎体前后缘骨质有无增生、颈椎上下关节突骨质有无增生等方面，对X线片进行评分。

图1 正常对照组颈椎侧位片图

图2 模型组实验4周颈椎曲度反弓

图3 模型组实验8周颈椎曲度变平，颈4椎体前缘增生

图4 模型组实验8周椎间隙明显狭窄，颈4-5 前缘增生，后关节间隙模糊

组 别4周8周模型组210±097﹡440±164＊＊﹟正常对照组150±105150±105

注：术后4周与正常对照组比较：﹡P>0.05; 术后8周与正常对照组比较：﹡﹡P<0.01; 术后8周与4周对比：﹟P<0.01

表1显示，术后4周模型组颈椎X线片评分与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明造模4周造模组颈椎退变不明显。术后8周，模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；造模组术后8周与术后4周比较差异有统计学意义(P<0.01)，表明造模8周模型组退行性改变非常明显，具有统计学意义。

2 超微结构观察

2.1 正常对照组

胶原纤维排列较有规则，分布密度较均匀，原纤维的粗细及相互间距大致相同，软骨样细胞呈椭圆形、短梭形或核椭圆形，胞浆内有粗面内质网、线粒体、糖原等细胞器。有的细胞周围见细胞周质，主要由细丝及颗粒状物质组成 (图5a、b)。

2.2 生理盐水组

病变重、胶原原纤维多数已溶解，仅残余一些定形物质，软骨样细胞已坏死，巢内仅留有电子密度高的细胞碎渣。有些坏死软骨样细胞的细胞周质仍可见，有些细胞周质亦溶解 (图6a、b、c、d)。

图5a 正常对照组髓核软骨细胞(×7000)

图5b 正常对照组胶原纤维(×7000)

2.3 颈康片组

病变中等，多数胶原原纤维排列较规则，部分区域胶原原纤维变性为团块状高电子密质物，个别区域胶原原纤维有溶解，局部残余小空隙或为无定形物质充填。绝大多数软骨样细胞改变轻，仅见细胞内线粒体等细胞器略有肿胀，有些软骨样细胞结构基本正常，坏死的细胞少见，但几乎大部分细胞的细胞周质明显增厚并变性，见一些块状高电子密度物质堆积(图7a、b)。

2.4 颈复康组

病变仍较重，部分胶原原纤维排列稀疏、较紊乱，部分胶原原纤维溶解，局部残余较大的空隙或残余一些无定形物质，绝大多数软骨样细胞坏死，偶见一些结构尚可的软骨样细胞，但其胞浆内脂肪滴有增多，线粒体有肿胀，有的软骨样细胞的细胞周质增厚明显(图8a、b)。

图6a 髓核软骨细胞坏死 (×3600)

图6b 髓核软骨细胞裂解坏死(×4800)

图6c 胶原纤维稀疏、排列不整齐(×6000)

图6d 胶原纤维扭结成毛线团状(×15200)

图7a 颈康片组髓核软骨细胞轻度退变(×4000)

图7b 胶原纤维排列较规则，但部分断裂(×4800)

图8a 颈复康组髓核软骨细胞轻度退变(×7000)

图8b 胶原纤维排列轻度紊乱，部分断裂(×6000)

3 讨论

3.1 关于颈椎病动物模型的建立

颈椎病发病机制复杂，故复制其模型较困难。目前国内外学者通过多种方法复制其模型，并对其发病机理进行了诸多探讨。Whitehill[7]通过损伤狗的前纵韧带纤维环和所有后部韧带结构造成颈椎不稳，术后3个月成模，并从放射学、生物力学及组织形态学方面对模型的恢复进行研究。Miyamoto[8]通过分离鼠脊柱后部附着于椎体的肌肉及切除棘突、棘上韧带和棘间韧带来造成颈椎病的模型，术后6～12月成模，并首次从病理学上证实颈椎病模型的成立。彭宝淦[5]通过切除兔颈棘上、棘间韧带和分离椎旁两侧的肌肉，3个月后建立颈椎病模型，并通过X线摄片检查及显微镜观察证实模型的成立。余家阔等[6]根据长期低头伏案工作的人易得颈椎病的情况，将家兔放入特制的低头位兔架中，每次低头2 h，每天2次，2个月后建立了颈椎病模型。此外，施杞等[9]根据中医病因学说，将风寒湿的刺激引入颈椎病造模过程中。实验中观察到，长期低头体位可造成颈部肌肉变性，加之风寒湿的不断刺激，加重了颈椎退行性改变。彭宝淦等[5]对颈椎病动物模型的椎间盘进行了形态学研究，在普通显微镜下见3个月造模组椎间盘纤维环出现裂隙，排列轻度不规则，髓核出现皱缩或变小。8个月造模组椎间盘髓核完全纤维化，纤维环板块层状结构消失、玻璃样变。赫永强等[10]采用透射电镜观察动物模型退变性颈椎间盘髓核超微结构的变化，可见造模2个月后开始出现退变软骨样细胞，细胞核固缩，细胞浆浓缩，线粒体肿胀，嵴消失，可见“髓鞘样”小体。

本实验参考文献报道的方法，将彭宝淦与余家阔两者的方法结合起来进行造模[5，6]，对术后4周及8周新西兰兔进行拍片检查，并参照余氏法评分对颈椎X线片进行评分及统计分析，模型组与正常对照组比较(P>0.05)，结果表明术后4周新西兰兔颈椎退变不明显；术后8周模型组与正常对照组比较，2组差异有统计学意义(P<0.05)，表明新西兰兔颈椎发生明显退变，与人体颈椎病椎间盘退变的病理改变相符。

3.2 颈康片方药分析

根据中医学理论，颈椎病属于中医学“痹证”范畴，神经根型颈椎病主要病机是肝肾亏虚、风寒入侵、气血经络失调，治疗原则为扶正祛邪。颈康片具有补益肝肾、活血化瘀、温经除痹等作用，由续断、葛根、桂枝、川芎、白芍、甘草、鸡血藤、威灵仙、制马钱子、羌活、桑枝、天麻等组成，其中续断补益肝肾、行血脉、续筋骨；川芎活血行气、祛风止痛；川芎 “上行头目，下行血海”，长于通行血脉，行气活血止痛”。鸡血藤行血补血、舒筋活络；威灵仙祛风湿、通经络、止痹痛；桂枝祛风寒湿、温经通络、辛温发散，透达营卫，善于外行肌腠，去除风寒。《石室秘录》曰：“手之麻木，乃气虚风湿中之，必须用手经之药引手中，而去风去湿之药始能有效……然必得桂枝，始能入于手经也。”白芍养血敛阴、柔肝止痛，同时桂枝与白芍相合，一治卫强、一治营弱，合则调和营卫，相须为用；羌活祛风胜湿、散寒止痛，配伍桑枝祛风通络、利关节、止痹痛，尤其适宜于上肢痹痛；天麻祛风湿、止痹痛，用于风湿痹痛及肢体麻木等证；葛根发表解肌、善治项背强痛，又可作为颈项部疼痛的引经药；葛根有良好的发表解肌作用，为解肌之代表药，常用于外感六淫之邪侵袭肌表引起的项背拘急之证；马钱子通络散结、消肿定痛，常用于风湿痹痛或拘挛麻木等症。《医学衷中参西录》认为，本药“开通经络，透达关节之力，远胜它药”。

3.3 颈康片对退变颈椎间盘髓核超微结构的影响

颈椎病好发于中老年人，当椎间盘发生退变时，其形态学结构必然会发生一些变化。本实验研究肉眼观察可见，正常对照组椎间盘中央矢状面剖开后髓核呈水凝胶状突出；而生理盐水组、颈康片组及颈复康组均见髓核变薄、含水量均有不同程度减少，呈软黏稠胶状，反光性减弱，其中生理盐水组外观改变最明显，由此可见其退变最严重。在给药4周后，通过电镜观察，颈康片组、颈复康组及生理盐水组等3组均有不同程度退变的表现，其中生理盐水组髓核退变程度最重，部分细胞退变、大部分细胞已坏死，胶原纤维明显退变；而用药2组髓核退变相对较轻，其中颈康片组髓核退变程度最轻，说明颈康片能够减轻新西兰兔颈椎间盘髓核组织软骨细胞及其胶原纤维的退变程度。Hashizume[11]的研究表明，椎间盘退变形态学首先产生的变化是部分软骨板从邻近椎体的分离。纤维环与软骨板是椎间盘的两条营养途径,当纤维环与软骨板的变性势必破坏了椎间盘内外物质的交换,促进了椎间盘退变，因此我们推测颈康片可能也是通过减轻纤维环与软骨板的变性，从而减轻椎间盘退变。

《黄帝内经》认为，“丈夫……五八，肾气衰……七八，肝气衰。”肝主筋，肾主骨，人到中年肝肾渐亏，筋骨容易发生退化。椎间盘属于“筋”的范畴，通过补益肝肾能够强筋壮骨，所以颈康片能够起到减轻颈椎间盘退变程度，改善神经根型颈椎病的症状。但从现代医学角度来看，颈康片通过什么途径发挥减轻颈椎间盘退变的作用，颈椎间盘退变程度减轻与症状的相关性等问题尚需今后进一步的研究。

[1] 林石明,李兆文, 林俊山.等. 颈康片治疗神经根型颈椎病的临床研究[J].内蒙古中医药，2013，32(14)：3-4.

[2] 张爱平，许书亮，陈弘修.颈痛宁主要药效学试验研究[J].福建中医学院学报，2001,11(2)：43-44.

[3] 林向前.颈康片质量标准研究[J].药物鉴定，2010,19(7)：32-33．

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[5] 彭宝淦，施杞，沈培芝，等.一个新的实验性颈椎病动物模型[J].中国中医骨伤科杂志，1997,5：11-12.

[6] 余家阔，吴毅文，戴先进，等.颈椎病生物力学发病机制实验研究[J].安徽医科大学学报，1990,25(1)：47-50.

[7] Whitehill R, Miran DJ, Fechner RE, et al. Cervical ligametous instability in cavine in vivo model[J]. Spine,1987,12(10):959-963.

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[9] 施杞，赫永强，彭宝淦，等.动静力平稳失调与颈椎病—颈椎病动物模型的实验研究[J].上海中医药大学学报，1999,13(1)：52-54.

[10] 赫永强，施杞.实验性颈椎动力平衡失调后髓核超微结构观察[J].临床骨科杂志，1999,4：247.

[11] Hashizume H. Three dimensional architecture and development of lumbar intervertebral disc[J]. Acta Med okayama,1980,34:301-314.