玉米秸秆糖醇发酵产丁二酸及表征

叶小金，王红蕾，王晓俊，徐洪章，薛冬桦

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012 ）

玉米秸秆糖醇发酵产丁二酸及表征

叶小金，王红蕾，王晓俊，徐洪章，薛冬桦*

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012 ）

以玉米秸秆糖醇液为原料，考察产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）X-1对不同单一碳源的同化能力，并验 证产琥珀酸放线杆菌可同化利用玉米秸秆糖醇液。利用Box-Behnken中心组合设计试验，通过响应面分析法优化发酵工艺参数为：玉米秸秆糖醇液初始还原糖质量浓度42.81 g/L、酵母膏质量浓度12.53 g/L、缓冲剂MgCO3质量浓度15.90 g/L，经5 L发酵规模实验，发酵周期48 h，丁二酸产率为85.1%，还原糖利用率为85.4%。经红外光谱和核磁共振表征其发酵产物为生物基丁二酸。

丁二酸；发酵；玉米秸秆糖醇液；产琥珀酸放线杆菌

丁二酸（succinic acid）是生物质炼制产品工程中最重要的碳四平台化合物，在化工、材料、医药、食品领域有着广泛的用途[1-3]。丁二酸作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等重要大宗化学品和专用化学品的基本原料，也是合成聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇丁二酸酯和聚丙二醇丁二酸酯等可生物降解高分子材料的原料[4-6]。

随着石油资源日益枯竭，生物质资源高效转化为丁二酸，是近年来国际上的研究热点。美国能源部将丁二酸列为12 种最有潜力的大宗生物基化学品的第一位[7]。国外研究机构已经陆续报道，乳清、芭蕉芋糖浆、棉花秸秆和甘蔗糖蜜等工农业废弃物发酵产生物基丁二酸[8-11]。国内积极推进以玉米秸秆为原料的非粮食生物质能源开发利用，开展了秸秆气化、固化，秸秆饲料和秸秆材料等多方面的研究[12-14]，玉米秸秆产业将成为推动非粮食生物质能源开发利用和发展循环经济的重要组成部分。

玉米秸秆含有35%～40%的纤维素，20%～25%的木质素，20%左右的半纤维素，通过稀酸处理-酶耦联水解将纤维、半纤维及多糖组分降解可发酵单糖，利用生物转化技术将其转化为平台化合物，具有产业化发展前景[15]。

本研究以玉米秸秆糖醇液为原料，产琥珀酸放线杆菌X-1为菌株，开展其菌株广谱碳源同化能力、发酵培养条件优化及生物基丁二酸表征研究，为廉价玉米秸秆糖醇原料生产丁二酸和生物质资源再利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）X-1（ATCC 55618），本实验室选育并保藏。

1.1.2 原料

玉米秸秆糖醇液（玉米秸秆酸-酶水解处理过程中加入生物化工醇釜底残留物（含35%多糖组分）由长春大成新化工醇有限公司提供。经高效液相色谱（Waters 410）分析玉米秸秆糖醇液中含葡萄糖50.83%、木糖31.37%、纤维二糖2.43%。

1.1.3 仪器与设备

Waters 600高效液相色谱 美国Waters公司；Perkin Elmer Spectrum One傅里叶变换红外光谱 美国PE公司；Avance 400核磁共振仪 瑞士Bruker公司；UV-5100紫外-可见光分光光度计 上海元析仪器有限公司；发酵罐 镇江新东方生物技术有限公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅 日本Sanyo公司；PHS-3C酸度校准仪上海雷磁分析仪器厂；DHP120恒温培养箱 上海实验仪器厂有限公司；超净工作台 苏州亿诚洁净技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 丁二酸发酵工艺流程

菌株→活化→种子液→丁二酸发酵→丁二酸菌悬液→离心（8 000 r/min）→上清液活性碳脱色→过滤→上清液浓缩→低温结晶（4 ℃）→丁二酸晶体

1.2.2 种子及发酵培养基

种子培养基配方（g/L）：葡萄糖2.5、胰蛋白胨17、大豆蛋白胨3、NaCl 5、K2HPO42.5，用1 mol/L的NaOH调pH值至7.0。发酵培养基配方（g/L）：玉米秸秆糖20～60、NaCl 1、CaCl20.6、MgCl20.6、K2HPO43、酵母膏8，pH 7.0。

1.2.3 菌种培养与发酵条件

活化的斜面菌株进行液体种子培养，37 ℃培养12 h。体积分数10%种子液装有100 mL发酵培养基的三角摇瓶（容积为250 mL），置于37 ℃、通入CO2进行厌氧培养，发酵周期48 h。5 L发酵规模培养，玉米秸秆糖醇液3 L，营养盐组成同上，发酵温度37 ℃，发酵周期48 h，搅拌转速120 r/min，通入100% CO2，通气量为0.1 L/min。

1.2.4 酸结晶法提取丁二酸

发酵液在转速8 000 r/min离心20 min去除菌体，2 g/100 mL活性碳去除杂质，HCl调pH值至2.0，旋转蒸发浓缩丁二酸发酵液，4 ℃低温结晶[16]。

1.2.5 丁二酸计算公式

式中：ρ1为初始还原糖质量浓度/（g/L）；ρ2为残糖质量浓度/（g/L）；ρ3为丁二酸质量浓度/（g/L）。

1.3 分析方法

1.3.1 菌体浓度的测定

菌体浊度（OD660nm）表示菌体生长状况，取1 mL菌液，稀释若干倍，用紫外-可见分光光度计于660 nm波长处测定光密度值[17]。

1.3.2 玉米秸秆糖醇液组分分析

Waters 410液相色谱仪，柱温80 ℃，示差检测器进行检测，BP-100Ca+色谱柱，采用面积归一法分析玉米秸秆水解液糖组分。

1.3.3 丁二酸分析

高效液相色谱分析丁二酸，色谱柱为Waters C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流动相为5 mmol/L硫酸，pH 2.5，进样量为10 μL，流速为1 mL/min。利用Waters 2487紫外检测器进行检测，检测波长为210 nm，采用外标法进行定量分析。

1.3.4 丁二酸红外光谱表征

丁二酸的红外光谱分析应用傅里叶变换红外光谱法，分辨率为4 cm－1，扫描范围为4 000～450 cm－1，KBr压片，KBr做背景扫描。测试前样品在50 ℃条件下，干燥至恒质量。

1.3.5 丁二酸核磁共振氢谱表征

以二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）为溶剂，采用核磁共振仪进行表征。

2 结果与分析

2.1 产琥珀酸放线杆菌广谱碳源同化能力

图1 产琥珀酸放线杆菌X-1对不同碳源的同化能力Fig.1 The ability of A. succinogenes X-1 to assimilate different carbon sources

依据高效液相色谱分析玉米秸秆糖醇液中含有六碳糖、五碳糖和少量纤维二糖。分别以葡萄糖、木糖、纤维二糖和玉米秸秆糖醇液为碳源，考察产琥珀酸放线杆菌X-1广谱碳源同化能力。由图1可知，产琥珀酸放线杆菌X-1能利用葡萄糖、木糖和纤维二糖，并可同化利用玉米秸秆糖醇液。提示此菌株具有广谱碳源同化能力，经戊糖磷酸途径同化利用戊糖[18]。

2.2 玉米秸秆糖醇液还原糖质量浓度对产丁二酸的影响

以玉米秸秆糖醇液为碳源，初始还原糖质量浓度分别为20、30、40、50 g/L和60 g/L，探讨产琥珀酸放线杆菌X-1生长及生物转化丁二酸影响。由图2可知，玉米秸秆糖醇液初始还原糖质量浓度从20 g/L增加到40 g/L时，丁二酸产量持续增加。当还原糖质量浓度为60 g/L时，发酵液中丁二酸产量开始下降，推测高质量浓度还原糖抑制菌株的生长及发酵代谢产物合成。确定玉米秸秆糖醇液还原糖质量浓度40 g/L，发酵48 h，丁二酸产量为17.9 g/L，丁二酸产率为72.8%。

图2 还原糖质量浓度对产丁二酸的影响Fig.2 Effect of initial reducing sugar concentration on the yield of succinic acid

2.3 氮源质量浓度对产丁二酸的影响

酵母膏富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素和微量元素，其作用不仅提供微生物生长的氮源，而且有利微生物丁二酸代谢合成[19]。本实验以酵母膏为氮源，玉米秸秆糖醇液初始还原糖质量浓度40 g/L条件下，考察不同质量浓度酵母膏对产丁二酸的影响。由图3可知，在适当的碳氮比条件下，随着产琥珀酸放线杆菌生长，丁二酸产量不断增加，当氮源质量浓度过高，菌体增长减缓，胞外代谢产物丁二酸生成降低。酵母膏质量浓度12 g/L（碳氮比为24.7）时，丁二酸产量为23.9 g/L，丁二酸产率为79.1%，还原糖利用率为75.5%。

图3 酵母膏质量浓度对产丁二酸的影响Fig.3 Effect of yeast extract concentration on the yield of succinic acid

2.4 MgCO3质量浓度对产丁二酸的影响

丁二酸发酵过程中，胞外代谢产物有机酸的积累会导致培养基质中pH值变化，以MgCO3为缓冲剂，在玉米秸秆糖醇液还原糖质量浓度40 g/L，酵母膏质量浓度12 g/L，发酵周期48 h条件下，探讨不同MgCO3质量浓度对产丁二酸的影响。由图4可知，MgCO3质量浓度5～15 g/L时，丁二酸产量逐渐增加，MgCO3质量浓度超过15 g/L，丁二酸产量变化较小。其机理为MgCO3在发酵过程中分解生成CO2，产琥珀酸放线杆菌X-1，经PEP羧化激酶途径固定CO2并生成丁二酸。最适MgCO3质量浓度为15 g/L，丁二酸产量29.0 g/L，丁二酸产率为83.6%，还原糖利用率为86.7%。

图4 MgCO3质量浓度对产丁二酸的影响Fig.4 Effect of MgCO3concentration on the yield of succinic acid

2.5 中心组合试验确定因素最佳水平

2.5.1 试验设计及结果

表1 Box-Behnken试验设计方案及结果Table1 Box-Behnken experimental design and results

在单因素试验结果基础上，运用Box-Behnken的中心组合设计原理，选定还原糖质量浓度（A）、酵母膏质量浓度（B）和MgCO3质量浓度（C）为变量，各选取3 个水平，试验因素编码及水平如表1所示。根据响应面分析试验软件设计三因素三水平共17 个试验点进行响应面分析。17 个试验点分为两类，一类是析因点，共12 个；一类是零点为区域中心点。零点重复5 次，用于估计试验的误差。

根据表1试验结果，以丁二酸产量（Y）为响应值，对数据进行回归分析，根据试验因子对响应值的影响可得方程：Y=29.20+1.99A+1.74B+1.38C+0.27AB+ 0.75AC+0.15BC－3.94A2－3.49B2－4.56C2。决定系数R2=0.931 1，说明方程的拟合度很好，可以用该回归方程替代真实试验点结果进行分析。

2.5.2 方差分析

回归方程的方差分析结果（表2）表明，一次项和二次项对响应值的影响是高度显著的，交互项的影响不明显，试验因子与响应值之间不是线性关系。方差分析结果还表明，“模型＞F”＜0.000 1远小于0.05，说明模型是显著的[20]。一般认为决定系数R2大于0.9，表明预测值能与实验值具有高度相关性。在本实验中，R2=0.931 1，表明仅有不到7%的丁二酸产量变异不能由该模型解释。

表2 回归模型方差分析Table2 Analysis of variance for the regression model

通过多元回归方程的响应面曲线图（图5）分析可知，回归模型存在最大稳定点。丁二酸产量（Y）的最大估计值为29.8 g/L，最佳点为A=42.81、B=12.53、C= 15.90，即还原糖质量浓度为42.81 g/L、酵母膏质量浓度为12.53 g/L、MgCO3质量浓度为15.90 g/L，此点丁二酸产量为29.8 g/L。

图5 各因素交互作用对产丁二酸影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for succinic acid production

2.6 发酵稳定性实验结果

对最佳点进行3 批次5 L发酵规模稳定性实验，每间隔4 h取样，发酵过程对菌体生物量、还原糖质量浓度以及丁二酸积累进行全分析，产琥珀酸放线杆菌X-1发酵结果（图6），发酵周期48 h时，丁二酸含量29.1 g/L，还原糖利用率为85.5%，丁二酸产率85.1%，表明预测值与验证实验很接近，说明回归方程能够比较真实地反映各因素对丁二酸发酵影响。

图6 5 L发酵规模实验Fig.6 Temporal curves for succinic acid production and reducing sugar consumption during fementation in a 5-L fermentor

2.7 生物基丁二酸结构表征

红外光谱可根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息确定物质分子结构并鉴定其化合物。由图7可知，2 400～3 300 cm－1处有宽吸收带，1 419 cm－1处有较强吸收， 说明存在—COOH，1 694 cm－1处为C=O伸缩振动吸收，1 207 cm－1和1 310 cm－1处分别为C—O伸缩振动和O—H 面内变形振动吸收，1 630～1 680 cm－1处没有吸收，提示不存在C=C键，与色谱纯丁二酸标样吸收峰吻合，发酵产物为生物基丁二酸。

图7 丁二酸红外光谱Fig.7 IR spectrum of succinic acid

图8 纯化后生物基丁二酸样品核磁共振氢谱Fig.8 1H NMR spectrum of the purified bio-based succinic acid

图8氢的核磁共振谱图提供了化学位移、偶合常数、积分曲线，由此可以推测质子在碳原子上的位置。以DMSO为溶剂，其中化学位移2.50处的吸收峰为溶剂峰，丁二酸的核磁共振氢谱数据采用文献[21]所述化学位移值，化学位移12.11为—COOH上的1H谱峰，化学位移2.41为—CH2—上的1H谱峰，峰面积比约为1∶2，进一步验证发酵产物为生物基丁二酸。且杂峰较少，提示酸结晶法提取生物基丁二酸纯度较高。

3 结 论

利用Box-Behnken中心组合设计试验，通过中心组合设计试验优化丁二酸发酵工艺，确定发酵最佳工艺参数为：玉米秸秆糖醇液还原糖质量浓度42.81 g/L、酵母膏质量浓度12.53 g/L、MgCO3质量浓度15.90 g/L。经5 L发酵规模实验，厌氧发酵48 h时，还原糖的利用率为85.4%，丁二酸产率为85.1%。

酸结晶法提取丁二酸，经红外和核磁共振表征，验证发酵产物为生物基丁二酸。为综合利用生物化工醇企业玉米秸秆糖醇产丁二酸，延长发酵产业链，增加副产物附加值，提供可行性研究。

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Fermentation and Characterization of Succinic Acid from Sugar-Alcohol Solution of Corn Stover

YE Xiao-jin, WANG Hong-lei, WANG Xiao-jun, XU Hong-zhang, XUE Dong-hua*
(School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

In this work, the sugar-alcohol solution of corn stover was fermented to produce succinic acid. The carbon assimilation ability of Actinobacillus succinogenes X-1 was investigated using different carbon sources and the strain was verified to be able to assimilate the sugar-alcohol solution to produce succinic acid. A Box-Behnken design was used to optimize three medium components by response surface methodology. The optimum medium was obtained by adding 12.53 g/L yeast extract as a nitrogen source, and 15.90 g/L MgCO3as a pH buffer to the sugar-alcohol solution containing 42.81 g/L reducing sugar. After 48 h of fermentation in a 5-L fermentor, the yield of succinic acid was 85.1% and the utilization rate of reducing sugar was 85.4%. The crystal of the fermentation product was obtained by acidic crystallization and succinic acid was characterized using infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance.

succinic acid; fermentation; sugar-alcohol solution of corn stover; Actinobacillus succinogenes

TQ921.7

A

1002-6630（2014）23-0161-05

10.7506/spkx1002-6630-201423032

2013-12-31

“十二五”吉林省教育厅科技支撑计划项目（201192）；长春市科技发展计划项目（2012213）

叶小金（1988—），男，硕士研究生，研究方向为生物化工。E-mail：yexiaojin88@126.com

*通信作者：薛冬桦（1957—），女，教授，博士，研究方向为生物化工。E-mail：xuedonghua@mail.ccut.edu.cn