碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药基因的研究

李光荣，宋 敏，杨建波，刘靳波

鲍曼不动杆菌是一种条件致病菌，其大量存在于医疗环境中，是引起医院感染的主要病原菌。近年来，多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii；MDR-Ab)和泛耐药鲍曼不动杆菌在临床中大量出现，其临床分离率位居我国临床常见革兰阴性杆菌第4位[1]，其感染率、耐药率和临床致死率日益严重，已引起医学界的高度关注。碳青霉烯类抗菌药物是一类新型的小分子、高效、广谱的β-内酰胺类抗菌药物，该药为迄今抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类抗菌药物，是治疗多种细菌混合感染及免疫缺陷者感染的一线药物。随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌不断出现并广泛传播[2]。鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶是碳青霉烯类抗菌药物的主要耐药机制之一，其能够水解碳青酶烯类抗菌药物而导致耐药。目前此类水解酶主要是Ambler分子结构分类法中的B类和D类β-内酰胺酶，B类酶又称金属酶，包括IMP型、VIM型等；D类酶又称苯唑西林酶，包括OXA-23、OXA-24、OXA-58 等[3]。为了解鲍曼不动杆菌的耐药性和碳青霉烯酶相关耐药基因的存在情况，本研究对临床分离的88株MDR-Ab进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 88株MDR-Ab来自2012年1月—2013年5月泸州医学院附属医院收集的临床标本，主要包括痰、分泌物、脑脊液、尿、血液、咽拭子等标本，其中呼吸道标本71株(80.7%)。标本来源科室主要为重症监护病房(ICU)和神经外科。

1.1.2 主要仪器与试剂 MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统购自西门子公司；C1000TM Thermal Cycle PCR扩增仪与GelDoc XR凝胶成像仪购自美国Bio-RAD，PCR引物由上海生物工程有限公司合成；Premix Tag酶体系及DNA Marker-A(GeneRuler 100 bp)购自上海生物工程有限公司。

1.1.3 引物设计 从Gen Bank中分别获得鲍曼不动杆菌的目的基因OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、VIM的基因序列全长，特异性引物序列参照文献[4]进行设计(见表1)。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定及药敏试验 88株MDR-Ab使用MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统鉴定并获得，同时此系统检测其对氨苄西林-舒巴坦、阿米卡星、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、环丙沙星、头孢吡肟、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、他唑巴坦、哌拉西林、复方新诺明、妥布霉素的最小抑菌水平(MIC)，所有MDR-Ab经检测鉴定后冻存于-80 ℃冰箱。实验操作及药敏结果判断标准参照2011年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准。药敏试验标准菌株为大肠杆菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。

表1 靶基因引物序列和产物长度

注：P1=特异性引物1(正向引物)， P2=特异性引物2(反向引物)

1.2.2 鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药验证试验 仪器法筛选鉴定出亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌，再采用纸片扩散法(K-B法)，亚胺培南、美罗培南药敏纸片对耐药鲍曼不动杆菌进行验证，药敏结果判断标准参照2011年CLSI标准。

1.2.3 DNA模板制备 采用煮沸法[5]，挑取已分纯单克隆菌落放入含1 ml 0.9%氯化钠溶液的塑料离心管(EP管)内，混匀后8 000 r/min离心2 min，离心半径为10 cm，弃上清液后加100 μl蒸馏水充分震荡混匀，95 ℃干浴10 min，再12 000r/min离心2 min，离心半径为10 cm，上清液即为检测模板。

1.2.4 反应体系及条件 靶基因引物识别序列和目的产物的PCR扩增体系均为：10×buffer 3 μl，MgCl21.8 μl，dNTPs 0.24 μl，P1和P2引物各1.2 μl，TaqDNA酶0.6 μl，DNA模板2.4 μl，用无菌水补足至总体积30 μl。扩增条件为：96 ℃预变性5 min，95 ℃ 35 s、55 ℃ 30s、72 ℃ 60s(循环34个周期)，72 ℃延长至5 min。

1.2.5 PCR产物扩增与成像 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳跑胶，采用无菌0.9%氯化钠溶液为阴性对照，出现目的条带即为检测基因阳性，凝胶成像系统观察并摄像保存。

1.2.6 PCR产物测序 PCR扩增阳性产物任选两个送上海生物工程有限公司进行纯化并测序，测序仪器为3730xl DNA Analyzer，测序试剂为BigDye terminator v3.1。

2 结果

2.1 药敏试验结果

2.1.1 常规药敏试验结果 88株MDR-Ab对β-内酰胺类药物(包括头孢菌素类如头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等；碳青霉稀类药物如亚胺培南)、氨基糖苷类药物(包括庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素等)、喹诺酮类药物(包括环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星)、磺胺类抗菌药(包括复方新诺明)等15种常规抗菌药物的抗菌活性见表2。对亚胺培南耐药率为54.5%，对头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林的耐药率均达到86.4%，对其他抗菌药物的耐药率为71.6%～86.4%。

表2 88株MDR-Ab对抗菌药物的敏感性

2.1.2 鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药验证试验结果 MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统检测出对亚胺培南耐药的48株鲍曼不动杆菌，在K-B法中对亚胺培南和美罗培南的耐药率均为100%(见表3)。

表3 MDR-Ab对亚胺培南和美罗培南K-B法药敏试验结果

Table3 The sensitivity test results of MDR-Ab to imipenem and meropenem by K-B method

药物耐药株数 %中介株数 %敏感株数 %亚胺培南481000000美罗培南481000000

2.2 基因检测结果

2.2.1 MDR-Ab的β-内酰胺酶基因扩增结果 对88株MDR-Ab进行OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、VIM基因检测，其中47株携带OXA-23基因，9株携带OXA-58基因，16株携带VIM基因，2株携带OXA-23+OXA-58+VIM基因，5株携带OXA-23+OXA-58基因，14株携带OXA-23+VIM基因；未检测到携带IMP、OXA-24基因的MDR-Ab(见表4)。

表4 88株MDR-Ab的β-内酰胺酶基因扩增结果〔n(%)〕

2.2.2 碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因扩增结果 48株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌中，34株携带OXA-23，9株携带OXA-58，15株携带VIM，13株携带OXA-23+VIM基因，5株携带OXA-23+OXA-58基因，2株携带OXA-23+OXA-58+VIM基因(见表5)。

2.2.3 PCR阳性产物电泳结果 对OXA-23、OXA-58、VIM基因扩增的阳性产物进行琼脂糖凝胶电泳跑胶，其电泳结果见图1～4。

2.2.4 PCR扩增阳性产物测序结果 OXA-23、OXA-58、VIM 3种基因经PCR扩增后的阳性产物测序结果经BLAST程序对比分析与NCBI的相应基因序列的同源性分别为99%、99%和97%～99%(见图5～7)。

表5 碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因扩增结果

Table5 The beta-lactamase gene amplification results of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

基因名称阳性菌株〔n(%)〕OXA-2334(708)OXA-589(188)VIM15(313)OXA-23+OXA-58+VIM2(42)OXA-23+OXA-585(104)OXA-23+VIM13(271)IMP0 OXA-240

注：M为GeneRuler100 bp ladder；N为阴性对照；1～7为阳性标本，1 058 bp

图1 OXA-23基因的扩增产物电泳图

Figure1 The results of electrophoresis products of OXA-23 gene PCR positive

注：M为GeneRuler100 bp ladder；N为阴性对照；1～7为阳性标本，780 bp

图2 VIM基因的扩增产物电泳图

Figure2 The results of electrophoresis products of VIM gene PCR positive

注：M为GeneRuler100 bp ladder；N为阴性对照；P为阳性对照；16sDNA，150 bp

图4 16sDNA基因的扩增产物电泳图

Figure4 The results of electrophoresis products of 16sDNA gene PCR positive

注：M为GeneRuler100 bp ladder；N为阴性对照；1～7为阳性标本，580 bp

图3 OXA-58基因的扩增产物电泳图

Figure3 The results of electrophoresis products of OXA-58 gene PCR positive

图5 鲍曼不动杆菌的OX-23基因部分测序峰图

图6 鲍曼不动杆菌的VIM基因部分测序峰图

图7 鲍曼不动杆菌的OX-58基因部分测序峰图

3 讨论

鲍曼不动杆菌是医院院内感染的主要病原菌之一，尤其是MDR-Ab的出现常导致感染者不治身亡[6]。感染控制界称之为“21世纪革兰阴性杆菌的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)”。鲍曼不动杆菌的耐药机制包括灭活酶、钝化酶导致抗菌药物失活；外膜蛋白缺失和细菌生物膜的形成导致细胞膜通透性改变靶位青霉素结合蛋白改变；细菌对药物的主动外排导致细胞内药物水平降低等。

本研究结果显示，MDR-Ab对β-内酰胺类药物(包括头孢菌素类、碳青霉稀类药物)、氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物的耐药率均较高，除对亚胺培南耐药率为54.5%，对其余14种抗菌药物的耐药率均在71.6%以上。中国耐药监测网显示，2009—2011年鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药率分别为54.8%、57.1%、58.1%，而本院2009—2011年鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率分别为16.8%、21.3%、57.1%。由此可见，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药情况相当严峻，并且随着时间的推移耐药率越来越高。分析其原因主要为：(1)细菌耐药基因自发性突变；(2)抗菌药物选择造成的环境压力，使耐药基因不断的遗传和传递。有资料显示,鲍曼不动杆菌的耐药情况与抗菌药物的使用率、总使用强度、β-内酰胺类药物和喹诺酮类药物的使用强度呈正相关[7]。本研究分离出MDR-Ab的标本以呼吸道标本为主(80.7%)，鲍曼不动杆菌极可能导致患者出现呼吸道感染，这与国内外大多数报道接近[8]。MDR-Ab临床感染科室以ICU和神经外科为主，主要是由于这些病房的患者病情较重，输液时间较长，插管等侵入性操作及激素、免疫抑制剂等治疗手段的应用使患者免疫力下降，在一定程度上造成了MDR-Ab的定植和扩散。同时为抗感染而预防性地大量使用抗菌药物，也诱导了耐药菌的产生，给临床治疗带来了很大困难[8-9]。

OXA-23基因是质粒和染色体介导的耐药基因，是鲍曼不动杆菌耐药的主要基因之一，其在各地的阳性率不同。本研究中88株MDR-Ab共检测出OXA-23(53.4%)、OXA-58(10.2%)、VIM(18.2%)3种基因，经BLAST程序对比分析，与NCBI的相应基因序列的同源性分别为99%、99%和97%～99%，其中OXA-23基因阳性率明显高于OXA-58、VIM、IMP以及OXA-24基因。OXA-23基因阳性菌株中不仅有对碳青霉烯类药物耐药株，也有敏感株。在48株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌中，OXA-23阳性34株(70.8%)，余琳等[10]和杨均均等[11]对碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌进行OXA-23基因检测，阳性率分别为75.8%和71.6%，本研究结果与之相近。说明OXA-23基因可能为鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制之一。本研究结果显示，鲍曼不动杆菌VIM基因阳性率为18.2%，OXA-58阳性率为10.2%，与汤凤珍等[12]的报道相似。表明这些基因与碳青霉烯类抗菌药物耐药有重要关系，同时也反映出各地区耐药率的差异。值得注意的是，本研究发现2株MDR-Ab同时携带OXA-23、OXA-58和VIM基因，5株MDR-Ab同时携带OXA-23和OXA-58基因，14株MDR-Ab同时携带OXA-23和VIM基因，说明多种耐药基因的携带是MDR-Ab对常用抗菌药物耐药的重要原因。

综上所述，细菌耐药是多种机制综合作用的结果，本研究显示MDR-Ab对碳青霉烯类抗菌药物耐药与携带多种基因密切相关，因此及时检测MDR-Ab的耐药性及耐药基因携带情况，对于预防和控制MDR-Ab感染具有重要意义。

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