江西省2009年至2012年甲型H3N2流感病毒耐药性分析

李健雄，熊英，施勇，龚甜，周珺，徐刚

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

·论著·

江西省2009年至2012年甲型H3N2流感病毒耐药性分析

李健雄，熊英，施勇，龚甜，周珺，徐刚

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

目的分析江西省2009-2012年甲型H3N2流感病毒M2以及NA基因的特点，掌握其耐药情况，为临床治疗和疾病控制提供参考。方法从江西省流感监测网中随机选择19株甲型H3N2流感病毒，经核酸提取和one-step RT-PCR扩增M以及NA基因片段，双向序列测定，采用DNAStar5.0和Mage4.0序列分析软件分析M2以及NA基因特征以及耐药性位点。结果19株毒株M2基因31位氨基酸均由丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)；所有毒株NA蛋白催化活性位点和辅助位点均未发生氨基酸替换。结论19株毒株均对金刚烷胺类药物耐药，对流感病毒神经氨酸酶抑制剂药物均敏感，但仍应加强对流感病毒的耐药性监测。

甲型H3N2流感；M2；NA；耐药性

甲型H3N2流感病毒是引起人类流感的甲型流感病毒的一个重要亚型，是上世纪第三次世界流感大流行的病原，在人群中流行近一个世纪，每次流感流行都给社会带来严重的经济损失,造成不同程度的人群超额死亡率[1,2]。目前，流感病毒药物主要有针对M2蛋白的烷胺类药物和神经氨酸酶抑制剂类药物[3]，但此类药的耐药株不断出现，并呈增加趋势。为了解我省甲型H3N2流感病毒耐药基因特征，本研究对江西省2009年至2012年分离的季节性H3N2流感病毒的NA基因和M2基因进行测序，分析我省甲型H3N2流感病毒的耐药性特点。

1 材料与方法

1.1 标本来源采集监测医院流感样病例咽拭子标本或流感疫情病例咽拭子标本。

1.2 病毒分离采用狗肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离，根据细胞病变和微量血凝实验方法(HA)来判断是否有病毒存在。将HA滴度≥1∶8的标本采用血凝抑制方法(HI)进行流感病毒型别鉴定(MDCK和标准血清均由国家流感中心提供)。所有毒株均经国家流感中心复核鉴定。

1.3 病毒选择选择19株来自不同时间、不同流感监测医院病例的咽拭子标本中分离到的甲型H3N2流感病毒，对其NA基因和M基因进行基因扩增和测序。

1.4 病毒RNA提取采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂对含流感病毒的MDCK细胞培养液进行病毒RNA的提取。

1.5 引物M基因MF1∶5′-AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGA-3′;MR1027∶5′-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTC-3′;NA基因NAFUc∶5′-TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3′NAR1104∶5′-ATCCACACGTCATTTCCATCGTCA-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成[4]。

1.6 RT-PCR扩增M基因和NA基因采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit试剂盒进行RT-PCR反应。RT反应条件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min。PCR循环如下：94℃40s，50℃40s，72℃1min30s，35次循环，72℃10 min。

1.7 核苷酸序列测定PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测定。

1.8 序列分析核苷酸和氨基酸同源性以及遗传进化分析采用DNAStar5.0、Mage4.0序列分析软件，烷胺类药物敏感参比株A/NewYork/55/2004的M2基因序列以及2009年至2012年疫苗株A/ Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Perth/16/2009(H3N2)、A/ Victoria/361/2011(H3N2)的NA基因序列作为参比分析，序列收录号分别为CY121126、CY116578、CY081429、KJ942682。

2 结果

2.1 M2基因核苷酸同源性及遗传进化分析19株病毒的M基因扩增产物经纯化、双向测序、序列拼接后,均获得246bp M2基因序列。经DNAStar5.0、Mage 4.0软件分析，与烷胺类药物敏感参比株(A/ NewYork/55/2004)的核苷酸序列进行比较，核苷酸序列同源性在98.4%～98.8%之间、氨基酸的同源性在95.1%～96.3%之间，而这19株病毒之间的M2基因核苷酸序列的同源性较高，达99.2%～100%；氨基酸序列的同源性达到97.6%～100%。在M2基因氨基酸序列的种系进化树(图1)上可见我省19株病毒在同一分支上。

图1 M2基因氨基酸进化树

2.2 M2基因耐药性位点分析对影响烷胺类药物敏感性的26、27、30、31和34位氨基酸进行了分析，所有19株病毒均发生了S31N的氨基酸替换,而26、27、30和34位均未发生变异，但是所有毒株均发生了T9R和N88D的突变。

2.3 NA基因核苷酸同源性及遗传进化分析对PCR获得的NA基因经核苷酸测序、序列拼接后，获得每株病毒NA基因片段序列1332bp。经DNAStar5.0、Mage4.0软件分析，这19株病毒之间的NA基因核苷酸序列的同源性为97.2%～99.9%；氨基酸序列的同源性为96.6%～99.8%。对NA基因氨基酸序列的种系进化树(图2)的分析发现，2009年、2010年的3株毒株、2011年的1株毒株和2009年～2010年疫苗株A/JiangxiDonghu/110/2011 (H3)、2010～2012年疫苗株A/Perth/16/2009(H3N2)在同一分支上，2011年毒株(除A/JiangxiDonghu/ 110/2011(H3))、2012年毒株和2012～2013年疫苗株A/Victoria/361/2011(H3N2)在同一分支上。

图2 NA基因氨基酸进化树

2.4 NA基因耐药性位点分析对NA蛋白酶催化活性位点(R-118、D-151、R-152、R-224、E-276、R-292、Y-406、R-371位)氨基酸和辅助位点(E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、E-227、H-274、E-277、N-294、E-425位)氨基酸进行了分析，所有毒株均未发生变异。

3 讨论

目前临床上用于流感治疗的药物主要有两类，一类是金刚烷胺类药物，包括金刚烷胺和金刚乙胺，这类药物于上世纪60年代被发现，1966年美国FDA批准应用于应对H2N2流感病毒的感染[5]。但1966年Cochran等就在组织培养株中发现了耐金刚烷胺突变株[6]。另一类药物是神经氨酸酶抑制剂,包括扎那米韦(zanamivir)、奥塞米韦(oseltamivir)、帕拉米韦(peramivir)和A-315675等，1993年最先研制获得扎那米韦，1996年首次合成奥斯他韦(达菲)，2002年达菲获准在中国推出[3]。该类药物对于甲、乙型流感病毒均有效,NA抑制剂是目前许多国家建议使用的抗流感药物。尽管神经氨酸酶抑制剂应用较晚，但是临床研究很快发现了神经氨酸酶抑制剂的耐药株。

M2蛋白是流感病毒M基因编码的膜蛋白,具有离子通道活性。金刚烷胺类药物是通过阻扰M2蛋白的离子通道，通过抑制病毒与宿主细胞膜的融合及病毒RNA的释放来抑制甲型流感病毒的复制。金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的药物，然而流感病毒极易对烷胺类药物产生耐药突变[7，8]，研究证明，耐药株的产生与M2蛋白跨膜区部分氨基酸的突变有关,现已证实L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位中的氨基酸只要有1个或1个以上的变异就会导致耐药株的出现[9-11]。突变的病毒保持良好的遗传特性，可以在人与人之间进行传播[11],因此，对流感病毒耐药性和突变位点进行及时的检测和长期监测显得尤其重要。本次研究中的19株病毒M2区氨基酸均发生了S31N的突变，说明所有毒株均对金刚烷胺类药物耐药，这与流感病毒对M2蛋白抑制剂(金刚烷胺类药物)普遍耐药的报道一致[12],而T9R和N88D的突变的意义尚不清楚，有待进一步研究。

流感病毒的神经氨酸酶(NA)是流感病毒NA基因编码的主要表面糖蛋白，容易发生变异。NA蛋白属于Ⅱ型膜蛋白，具有糖苷外切酶活性，它的作用是水解神经氨酸结合的底物，即宿主细胞膜上多糖受体末端的N-乙酰神经氨酸，使子代病毒从宿主细胞表面释放和扩散。流感病毒神经氨酸酶的八个氨基酸(R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371和Y-406)作为酶催化活性位点直接作用底物或者作为维持功能的重要因素，而其他11个氨基酸(E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、1-222、E-227、H-274、E-277、N-294和E-425)作为辅助位点[13]。神经氨酸酶抑制剂作用于酶催化活性位点或辅助位点[14]，通过竞争性地结合NA蛋白上的特定区域，使神经氨酸酶水解功能降低，从而阻碍子代流感病毒颗粒的扩散，可以有效地阻断流感病毒感染、复制和传播的过程。不同酶催化活性位点或辅助位点的变异可导致对不同神经氨酸酶抑制剂的耐药，奥斯他韦耐药株出现H274Y、R292K位的替换，扎那米韦耐药株出现E119V、R292K的替换，帕拉米韦出现R292K位的替换，A-315675出现E119V的替换。本次研究显示我省H3N2流感病毒NA基因在2010年发生了一定的变异，而我国在2010年也改变了疫苗株的代表株。对突变重要位点分析可知，所有毒株在各重要位点均未发生氨基酸的替换，提示我省H3N2流感对神经氨酸酶抑制剂是敏感的，与北京报道一致[15]。

世界卫生组织在1999年建立了耐药性监测机构-NAIs抑制剂敏感性全球网络(neuraminidase inhibitor susceptibility network,NISN),其目的是收集数据并监视耐药性的出现,确定是否存在耐药突变下的敏感性降低,并用于讨论公共健康及可能出现的耐药性监管问题，这突出了流感敏感性检测的重要性。随着流感病毒耐药率的逐年上升,耐药毒株的传播也对我们提出了警示，对病毒耐药性的监测显得尤为重要,其对于流感疫情控制,指导临床用药具有重要意义。

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Resistant analysis of H3N2 influenza virus in Jiangxi provience during 2009-2012

LI Jianxiong,XIONG Ying,SHI Yong,et al.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330029,China.

Objective To analyze the characteristics of M2 and NA genes of H3N2 influenza virus in Jiangxi provience during 2009-2012.Methods Nineteen strains of H3N2 influenza virus were randomly selected for detection and virus RNA were extracted.Fragments of M2 and NA genes were amplified by one-step RT-PCR and then were sequenced.The data obtained were analyzed with the software DNAStar5.0 and Mage4.0.Results All strains of H3N2 influenza virus had amino acid changed at site S31N in M2 gene.All strains of H3N2 influenza virus had no mutation in catalytic residues and framework residues of NA gene. Conclusions The 19 strains were resistant to amantadine,and sensitive to neuraminidase inhibitors,however,continuous resistance surveillance is also necessary for control and prevention of influenza.

H3N2 influenza;M2 gene;NA gene;Resistance

R737.1+3,R511.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0667-03DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.006

2014-09-01；

2014-10-08)

江西省卫生厅科技项目(编号：20112003)

∶李健雄，出生于1986年7月，硕士,技师,研究方向为病毒检验。