布鲁菌常规检测与结果分析

廖晚珍，曾令兵，胡妮娅，胡雪飞，彭卫华，孙爱娣，余阳，刘洋

(南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006)

·论著·

布鲁菌常规检测与结果分析

廖晚珍，曾令兵，胡妮娅，胡雪飞，彭卫华，孙爱娣，余阳，刘洋

(南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006)

目的探讨简便可靠实用的布鲁菌早期检出方法，为布鲁菌病的及时诊治提供依据。方法应用BACTEC 9120或BACT/ALERT 3D等系统进行血或骨髓培养，然后取阳性瓶增菌液转种血平板和巧克力等平板，再经VITEK-2-Compact全自动微生物分析仪或API 20 E鉴定系统进行菌种鉴定。结果布鲁菌在上述血培养仪的瓶中2～4d可获得阳性生长物，经VITEK-2-Compact仪(或API 20 E鉴定系统)次日能得到鉴定结果。结论Compact鉴定仪(或API 20E鉴定系统)对布鲁菌的鉴定简单、可靠、经济、实用，且不会漏检和误检，是目前常规检测布鲁氏菌的可靠方法。

布鲁菌；血培养；细菌鉴定仪；早期诊断

布鲁菌病(Brucellosis，布病)是由布鲁菌(Brucella)侵入机体引起世界性、多宿主感染的人兽共患传染病[1]，以人类感染有关的动物主要是牛、羊、猪(国内则以羊为主)。近年来，布病的人畜疫情在我国和世界部分国家、地区都出现了回升势头，据国家疾病监测系统的病例统计显示：人间布病病例报告逐渐上升，西北、东北某些省份、内蒙古流行相当严重，有些布病罕见的地区临床报道也在增多，现已陆续覆盖各地，而且布病所引起的临床症状日趋多变，表现复杂，病情轻重不一，且多个系统受损。总之，特征性的病例现已较少见到，因而在一定程度上给临床的早期诊断带来不少困难。目前，布病的防控形势越来越严峻。传统的布鲁菌或生物型鉴定主要依据CO2的生长要求、H2S、噬菌体裂解、硫堇、碱性复红染料抑菌试验和单项特异性血清(A、M和R血清)凝集试验[2]，该分型方法是金标准，其缺点是操作复杂、时间长。近年来应用PCR方法检测BCSP 31属基因与AMOS种/型基因[3，4]即获得属、种特异条带，但过程比较复杂，且受条件的限制而难以广泛应用，不适合布病的临床常规诊断。本研究采用美国BD公司与法国生物梅里埃公司的血培养系统先进行血液(或骨髓液等)的增菌培养，再利用纯培养物经VITEK-2-Compact全自动微生物分析仪或API 20 E鉴定系统进行布鲁菌的鉴定，该方法简便、可靠、经济、鉴定周期短，其结果能为临床诊断布鲁氏菌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 简要临床资料病例1，岳XX，男，工人，35岁。主诉：反复发热2个月，乏力1月余。2013年6月10日无明显诱因出现发热，最高时39℃，伴畏寒、咳嗽、咳痰。当时在本地医院给予左氧氟沙星、阿奇霉素等抗炎4d，体温正常后出院。8月14日患者又发热，再入当地医院，给予上述同样的药物治疗，体温正常后出院。9月22日再次发热，最高时40.2℃，入我院感染科。当天给予地塞米松静滴并送骨髓液培养，由于体温仍高于38℃，又给予莫西沙星抗感染、恩替卡韦抗病毒治疗，体温正常后出院。出院后实验室报告骨髓液中培养出马尔他(羊)布鲁菌。患者出院后3d又发热，最高时39℃，再入我院。

病例2，李XX，男，工人，66岁。主诉：反复发热1个月。2013年7月中旬出现不明原因发热，以中午、夜间为主，体温38.5℃，伴有大汗，入我省某省级人民医院，住院期间血培养阳性(但未鉴定出布氏菌)，临床只好以一般革兰阴性杆菌感染予以左氧氟沙星治疗，体温正常后出院。7月下旬患者又发热，因未作任何处置，体温一直在38℃上下，8月12日入我院中医科，16日抽取骨髓液培养，22日报告培出马尔他布鲁菌，转感染科治疗。

病例3，谭XX，男，学生，15岁。主诉：发热40余天，浅表淋巴结肿大10余天。2013年6月初患者出现不明原因发热，热形不规则，最高时39.8℃，自行服感冒药症状无改善，遂当地诊所予以抗感染治疗后体温降至正常(用药不详)，但有反复。6月29日家属发现患儿颈部、腋窝多个肿大淋巴结，至本县中医院诊治，并予以抗感染治疗(用药不详)，体温仍反复。7月5日至我院就诊，门诊以“发热待查”收入感染科。入院后曾考虑淋巴瘤(彩超证实颈部、腋下、锁骨上、腹股沟有肿大淋巴结)送淋巴结活检和抽血液培养，同时给予头孢西丁抗感染等，但患儿7月9日仍发热，最高时39.2℃，口服退热药能降至正常，但易反复，7月10日送骨髓液培养并行头孢噻肟治疗，3天后体温正常，7月15日淋巴结病理报告为慢性炎症、排除淋巴瘤。7月16日再次发热，当日血液和骨髓液培养均报告为培养出马尔他布鲁菌。追问病史，患儿曾有羊接触史。

病例4，李XX，女，农民，53岁。主诉：反复发热。2012年4月初开始连续发热20余天，最高时39℃，治疗后体温正常(用药不详)。7月1日患者又发热，最高时39℃，多数于午后或下午，可持续约10小时才能自行降至正常。因诊断不清，于7月6日以“发热待查”收入我院感染科。入院后给予莫西沙星和安乃近与双氯芬酸钠栓治疗，但仍有发热。由于发热原因不明，且三系减少、脾肿大等需要进一步检查，但又涉及到费用和检查风险，患者要求出院。出院后不久又发热，最高时39℃，8月15日再入我院，16日送骨髓培养，22日报告培养出马尔他布鲁菌，追问病史，患者既往有服用未消毒牛奶和羊奶史。

病例5，李XX，女，学生，22岁。主诉：发热半个月。2012年4月18日出现发热，最高时41℃，一般午后逐渐升高，伴畏寒等不适，当时入本地县医院给予头孢哌酮/他唑巴坦点滴，但仍发热。5月2日入我院感染科，3日体温39.2℃，抽取血液和骨髓液送培养，同时给予头孢哌酮钠2.0g静脉点滴(Bid)，仍高热(39.8℃)，后改用美罗培南0.5gQ8h，体温降至38.4℃，5月10日血液和骨髓液均培养出马尔他布鲁菌(此前4月24日当地县医院培养为阴性)。追问病史，患者既往有羊接触史和食羊肉史(后来其父亲和妹妹都检出布鲁菌)。

病例6，陈XX，女，52岁，工人。主诉：反复发热4个多月。2013年6月27日突然发热，39.5℃，畏寒。自行服感冒药后会大量出汗，然后体温降至正常，但停药后又上升，再服感冒药，体温又下降。如此反复1周病情不见好转后于7月4日入当地市级医院并给予头孢曲松钠静滴，治疗无效后改用阿莫西林/克拉维酸钾与克林霉素治疗4d后热退，此后体温正常。8月上旬患者又发热，39℃以上，又行上述药物治疗5d后热退，此后体温一直稳定。10月上旬患者出现关节痛并发热，39℃以上，继续上述药物治疗5d后，体温又恢复到正常。11月5日再次发热，39℃，入我院风湿免疫科治疗，同时送骨髓液和血液培养，考虑到患者有关节痛和发热，还是给予激素和抗风湿治疗，11月11日骨髓液和血液均培养出马尔他布鲁菌。

上述6例中男性3例、女性3例，已婚4例、未婚2例，工人3例、农民1例、学生2例，年龄15~66岁，均有反复发热，最长4个月、最短半个月，最初发热时均无明显诱因，大部分呈高热(5例39℃~41℃，1例38.5℃)。6例中1例有羊接触史及全身淋巴结肿大，1例有服用未消毒牛奶和羊奶史，1例有羊接触和食羊肉史(其父亲与妹妹都检出布鲁菌)。6例经病原学确诊后即按WHO的标准治疗方案以多西环素、利福平治疗后痊愈。

1.2 细菌培养与鉴定由病房护士以无菌技术抽取静脉血液注入BACTEC 9120含树脂需氧培养瓶或BACT/ALERT 3D需氧中和抗生素培养瓶中，每瓶5~10ml(骨髓液则由医生抽取2~3ml)，培养瓶送至微生物室并及时放入血培养仪中，待阳性报警后再抽取瓶中标本接种血平板、巧克力等平板以及涂片革兰染色，平板放置5%二氧化碳环境孵育24~48h，然后挑取纯培养物进行第二次涂片染色并调至所需浓度上机进行菌株鉴定，仪器与相关配套材料为法国生物梅里埃公司的VITEK-2-Compact与GN-21341卡。鉴定仪按ISO 15189认证标准，每月采用ATCC25922、ATCC25923、ATCC 27853、ATCC 700323、ATCC 700603、ATCC 700327对检测仪进行室内质控。

1.3 分子生物学检测随机抽取6株菌中1株菌(即病例1)作为分子生物学的检测标本。DNA提取：抽取经VITEK-2-Compact仪器鉴定为布鲁菌纯培养物接种巧克力平板，培养48h后采用煮沸法提取细菌核酸。BCSP 31-PCR法菌属鉴定：采用布鲁菌属特异性基因BCSP-31作为定属基因，按照文献[5，6]提供的引物序列和参数进行BCSP-PCR检测。AMOS-PCR法菌种鉴定：采用文献[7]提供的以布鲁菌属插入系列IS711为基础建立的牛(A)、羊(M)、绵羊附睾(O)、猪(S)种布鲁菌多重PCR (AMOS-PCR)进行种鉴定(阳性对照菌株与PCR相关试剂分别购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所与大连宝生物工程有限公司)。

2 结果

2.1 细菌培养与鉴定结果血液或骨髓液接种血培养瓶后一般3～4d出现较明显的细菌生长(仪器阳性报警)，转种血平板、巧克力平板48h后可见大小约0．5mm、圆形、边缘整齐、无色半透明、呈露滴状、折光明亮、表面光滑湿润、稍隆起、均质样菌落。革兰染色为阴性短小杆菌，多为单个、少数呈双排列，菌落、菌体形态符合布鲁菌。挑取巧克力平板菌落接种GN-21341卡上机并过夜后仪器自动判读为马尔他布鲁菌(6株布鲁菌经江西省CDC布鲁菌虎红玻片凝集试验均为阳性，即试管凝集试验效价1：200～1：400)。

2.2 分子生物学检测结果采用分子生物学方法对其鉴定，布鲁菌属特异BCSP-31-PCR检测出225bp的特异条带(图1)，种特异AMOS-PCR鉴定为羊种布鲁菌(图2)，与上机鉴定结果完全一致。

3 讨论

布鲁菌病过去多见于牧区，近年来农村和城市的病例也在增多。该病的临床表现多样，除了间断发热，特殊症状和体征较少。因此，必须与其他发热性疾病相鉴别，从患者感染标本中分离出布鲁菌为确诊的依据。漏检和错报都将给诊治带来严重的后果。本研究中病例2、5就是两个典型病例。病例2，2013年7月中旬在我省某省级人民医院住院时(即第一次发热)血培养呈阳性，本来很有诊断价值，但该院微生物室未能鉴定出布鲁菌，只报告为“培养出阴性杆菌”的报告，导致临床按一般革兰阴性杆菌败血症治疗。病例5也存在类似的问题，患者2012年4月18日开始发热，但4月24日的血培养报告为阴性，该“阴性”结果是否与患者用药(头孢哌酮/他唑巴坦)、采血时机等因素有关，还是检验人员自身的问题，现已不得而知。

图1 布病患者随机抽样分离菌株BCSP31-PCR结果

图2 布病患者随机抽样分离菌株AMOS-PCR结果

对于布病，除在发热期应尽早抽血液或骨髓外，其他标本如尿液、脑脊液、乳汁等也应尽量做细菌培养与鉴定。而病例6，患者不明原因发热4个多月，在当地市级医院住院时，有条件做培养而未做血液与骨髓培养，结果导致诊断和治疗不及时。从该患者在我院的血培养情况看，如果按照常规设置即血培养瓶放置血培养仪中5d不报警为阴性，并且不做盲传就报告无菌生长的话，这份血标本肯定漏检。而实际情况是，患者11月上旬抽血做培养，5d中仪器无阳性报警，考虑到该患者的特殊性，仍转种血、中国蓝、巧克力平板。但2d内血、巧克力平板未生长细菌(中国蓝平板本来就不生长)。出现这种情况，我们推测患者较长时间、反复多次、大量使用抗生素，细菌的生长已受到了影响。因此，当血培养瓶为阴性时，应延长培养时间。另外，血平板、巧克力平板不长菌时也应延时，并在1d、2d、3d甚至更长时间内每天观察菌落生长情况。

从病例1、3、4来看，尽管不存在病原学检测的问题，但临床诊治上仍有不足。如病例1，该患者二、三个月内反复出现高热，并有养羊史，应考虑布病，尤其是已经怀疑患者有布病时，住院期间应积极询问并关注骨髓培养的结果和相关方面的信息，而不是体温一下降就嘱其出院，结果导致患者再次发热重返医院，增加了病人的痛苦和经济负担，更重要的是失去最佳的治疗时机。而病例3临床主要被患者全身肿大的淋巴结所迷惑，而考虑淋巴瘤。但是，病史询问不全面，等到淋巴结报告为炎性、血液和骨髓液培养都报告为马尔他布鲁菌之后才去追问患儿有无羊接触史，似乎太晚。此外，发热性的病种考虑得太局限也是影响诊断的一个因素。病例4主要是患者本身的问题导致诊断与治疗受到了影响。布病最具特征性的表现为反复发热、尤其是高热的特点，本文的6个病例其临床表现也是如此，少则2次、多则5次，一般都有2～3次高热过程。未确诊前医生都不会轻意使用对细胞壁有穿透力的药物，一旦确诊又必须使用这类药物，因为布鲁菌系细胞内寄生性致病菌，临床一般首选多西环素(强力霉素)与利福平的联合，或利福平联合四环素、利福平联合链霉素或链霉素联合多西环素。次选磺胺增效剂(TMP/SMZ)。复方磺胺甲噁唑片也有效，但复发率30%，而利福平联合多西环素复发率仅5%，复发病例采用利福平联合多西环素治疗仍然有效。对于孕妇布病首选利福平，若无效可单独给予四环素或甲氧苄胺嘧啶，忌用链霉素。由于布病病程长，无论采用上述哪种方案，用药时间至少6周。实践证明，布病只要正规用药一般都能治愈。反之，使用其他抗生素治疗毫无效果，本文的6个患者都先后、分别使用过青霉素类的阿莫西林/克拉维酸钾，喹诺酮类的环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星，头孢菌素类的头孢西丁、头孢哌酮、头孢哌酮/他唑巴坦、头孢曲松，碳青霉烯类的美罗培南，大环内酯类的阿奇霉素，克林霉素类，激素类的地塞米松，抗病毒类的恩替卡韦，抗感冒药和退热药等，无论临床使用多长时间(如病例4莫西沙星就连续静滴12天)、多大剂量、一次还是多次、一种单用还是多种联用都无法杀灭布鲁菌，只能暂时降低患者的体温。一旦停用，又会反弹。布病治疗的失败往往不是布鲁菌对药物有抗性，而是选药不当或疗程不足，尤其是因症状减轻而擅自终止用药所致。本研究还证明，布病的关键在于诊断，诊断的关键在于病原学，而病原学的关键在于血液(或骨髓液)的培养与分离，然后是准确的鉴定。血液是最常用的标本，而且急性期培养阳性率很高。目前医院主要依靠VITEK-2-Compact和API 20 E，而VITEK-2-Compact以外的型号，如：VITEK 32等、ATB以及BD Phoenix-100与DADE BEHRING Microscan walk-Away 40 SI系列仪器等无法检出布鲁菌。因为这些仪器的细菌鉴定名录数据库中没有布鲁菌属，所以无法鉴定出布鲁菌，而VITEK-2-Compact是新一代的全自动快速微生物鉴定智能分析系统，优化和扩大了微生物数据库。我们查阅了近3年国内报道的若干布鲁菌病例，均由该仪器鉴定得出。至于API系统，作为细菌鉴定的金标准，Dhar等[8]早就采用API 20E板条鉴定出布鲁菌属。因此，没有VITEK-2-Compact仪或不使用API 20 E系统进行检测就有可能漏检。一旦漏检，临床就无法诊断和治疗，这对患者和疫情的控制都将带来严重的后果。但血培养系统无论采用BACTEC 9120还是BACT/ALERT 3D等都能在3～4d培养出布鲁菌。布鲁菌属于第2类病原体，应在三级生物安全实验室中进行检验。但上述病例的出现表明，在二级生物安全实验室的日常临床检验过程中肯定会遇到携带布鲁菌的标本。而在实际工作中，微生物室检验人员未必能及时了解患者的病史及疫情接触史。因此如何尽早发现携带布鲁菌的标本，这是做好检测与防护、特别是防止实验室工作人员布鲁菌感染发生的关键。结合上述病例的检测结果，我们认为：当血液(或骨髓液)等标本中的培养物直接涂片见到云雾状革兰阴性短小杆菌，转种血平板、巧克力平板48h以上才有明显细菌生长、且菌落无色、透明、湿润、细小、氧化酶阳性，菌落涂片仍然为阴性短小杆菌，患者白细胞计数正常或偏低、但淋巴细胞升高时，应考虑标本中布鲁菌存在的可能性。此时应加强与临床的联系，包括流行病学资料的收集。

对于布鲁菌药敏，目前还没有推荐的方法，所以药敏试验可不作为常规检测，只是在十分需要时才做，并建议使用稀释法。

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Routine detection and analysis of Brucella

LIAO Wanzhen，ZENG Lingbing，HU Niya，et al.The First Affiliated Hospital of Nan Chang Uniuersity，Nanchang 330006，China

Objective To explore a reliable early detection method of Brucella for the early diagnosis and treatment of Brucellosis.Methods Specimens were cultured in Bactec 9120 or BACT/ALERT3D system,and then turned to the blood or chocolate plate to grow.Finally,picked single colony and inoculated into GN-21341 card,then identified strain with VITEK-2-Compact system(or cultured in API20E).Results Brucella has a significant growth in 2-4 days,by culturing in the two supporting systems shown above.Conclusions VITEK-2-Compact system(or API20E)is more simple,reliable,economical and practical than molecular biological or classical identification methods.In addition,this system would not miss any positive results,and is the only one automately routine testing of equipment models at present.

Brucella;Blood cultre;VITEK-2-Compact;Early detection

R446.5

A

1674-1129(2014)06-0670-04DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.007

2014-10-18；

2014-11-05)

廖晚珍，男，出生于1952年，主要从事临床细菌、真菌与分子生物学研究。