江西地区1927例骨髓捐献人群HLA-A、B、DRB1的多态性探讨

孙瑜，彭继红，李国良

(江西省血液中心，江西南昌330077)

·论著·

江西地区1927例骨髓捐献人群HLA-A、B、DRB1的多态性探讨

孙瑜，彭继红，李国良

(江西省血液中心，江西南昌330077)

目的分析江西地区骨髓捐献人群人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)A、B、DRBl等位基因的多态性分布特征。方法应用流式-序列特异性寡核苷酸探针方法(Flow-SSO)与直接测序法(SBT)检测江西地区1927例骨髓捐献者的HLA-A、B、DRBl基因座位，采用Arlequin3.5软件计算HLA等位基因频率、单倍型频率和连锁不平衡参数等。结果低分辨状态下3个基因座分别检出17、29和12个等位基因，3个座位分布频率最高的等位基因分别是HLA-A*02(0.3064)、HLAB*40(0.1889)和HLA-DRBl*9(0.1917),最常见的单倍型为HLA-A*02-B*46-DRBl*09(0.0721)。该人群HLA-A、B、DRBl等位基因在高分辨检测情况下分布不符合Hardy-Weinherg平衡(P＜0.05)。结论江西地区骨髓捐献人群HLA-A、B、DRBl等位基因和单倍型具有较高的遗传多态性。

HLA；多态性；中华骨髓库

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.004

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人类最复杂的遗传多态性系统[1]。其等位基因和单倍型频率在不同人群中存在明显差异，这些差异对人群的起源、进化、迁徙及与其他人群的亲缘关系等研究具有重要意义[2]。

本研究中我们应用流式-序列特异性寡核苷酸探针方法(Flow-sequence specific oligonucleotide probe，Flow-SSO)与PCR-直接测序法(polymerase chain reaction-sequence-based typing,PCR-SBT)对2009-2011年1927名江西籍无亲缘关系健康汉族个体骨髓库捐献人群进行了HLA-A、B和DRB1座位基因的高分辨分型，并对得到的数据进行了分析。

1 材料与方法

1.1 对象2009年至2011年健康、无血缘关系的江西本地汉族造血干细胞志愿捐献者1927例，根据知情同意原则采集EDTA抗凝静脉全血5ml。

1.2 DNA提取应用美国Gentra公司手工提取全血基因组DNA，严格按试剂盒说明书获取DNA，使用紫外分光光度仪检测DNA浓度与纯度，调整至DNA浓度20～100ng/μl，纯度1.7～2.0。

1.3 HLA-A、B和DRBl基因分型

1.3.1 Flow-SSO方法采用Flow-SSO分型试剂盒(德国诺诗康瀛公司)，严格按照试剂盒说明书操作，结果由Luminexl00 IS分析软件自动判读。

1.3.2 PCR-SBT方法对Flow-SSO方法显示结果模棱两可者采用PCR-SBT分型试剂盒(德国诺诗康瀛公司)，严格按照试剂盒说明书操作，结果由软件自动判读。

1.4 数据分析应用Arlequin3．5软件[3]，采用最大数学预期值算法(expectation-maximization，EM)估算基因频率和单倍型频率，行Hardy-Weinberg平衡检验，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 HLA-A、B、DRBl基因频率在A、B、DRBl座位的低分辨水平上分别检出了17、29和12个等位基因，高分辨水平上分别检出了45、82和46个等位基因。3个座位分布频率最高的等位基因分别是A*02(0.3064)、B*40(O.1889)和DRBl*09(0.1917) (表1)。

表1 江西地区汉族HLA-A、B、DRBl座位等位基因及频率(n=1927)

2.2 HLA-A*-B*-DRBl*单倍型频率低分辨状态下共观察到646种单倍型，最常见者为A*02-B*46-DRBl*09(0.0721)(表2)；高分辨状态下共观察到1621种单体型，最常见者为A*02∶07-B*46∶01-DRBl*09∶01(0.0602)

表2 江西汉族频率大于0.005的HLA-A＊-B＊-DRBl＊单倍型分布

2.3 Hardy-Weinberg平衡调查该群体的3座位基因，以高分辨结果判断,三基因座的杂合度观察值与期望值的差异均有统计学意义,显示各位点基因型分布均偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)(表3)。

表3 三基因座Hardy-Weinberg平衡检验

3 讨论

作为人类免疫系统的重要成员，HLA基因位于6号染色体短臂上，表达产物为细胞表面的肽受体，可以结合来自细胞内外的肽而形成HLA-肽复合物，抗原递呈细胞将此复合物递呈给T细胞，从而诱导T细胞分化发育，启动免疫应答。

HLA基因有着明显的人种分布特异性，已有许多关于其基因分布的报道[4,5]。目前，三座位单体型频率被用于研究人种之间和民族之间的遗传学差异[6],估计找到HLA匹配供者所需要骨髓库供者数[7]等。

本研究中我们采用Flow-SSO基因分型技术及SBT技术与对中国江西地区1927名健康汉族个体进行HLA-A、B、DRBl座位基因分型，在低分辨水平上,江西地区汉族人群HLA-A、B、DRBl三个座位分别检出17、29和12个等位基因，这些等位基因理论上可以组合成17×29×12共计5916种A*-B*-DRBl*单倍型，但实际只观察到646种，占理论数的10.92%,而高分辨的单倍型所占理论数更少(1621/169740),该数据提示在江西地区人群中HLA单体存在显著的连锁不平衡，具体情况我们将另文讨论。低分辨情况下，江西地区汉族人群中频率大于0.01的三座位单倍型有16种，均由江西地区常见等位基因组成[8,9]，其中最常见的单倍型是A*02-B*46-DRBl*09，而高分辨的状态显示，该单倍型主要是由A*02∶07-B*46∶01-DRBl*09∶01构成，该数据与广州人群相似[10],一方面提示携带这种单倍型的器官或造血干细胞移植患者在本地汉族人群找到HLA相匹配供者的概率较高，另一方面也提示江西人群与广州人群可能存在地缘关系的相近之处。

从Hardy-Weinberg平衡检验来看,某些位点的基因分布偏离H-W平衡,在一些研究中也有报道[4,5]，这可能与罕见基因的干扰、样本量、样本选择压力等相关,该偏离有望随着样本量的进一步扩大而得到纠正,我室的结果推导出同样的结论。我室曾对江西地区汉族人群的HLA中低分辨率结果行Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示该人群均处于遗传平衡状态[8,9]，但对3个座位的高分辨基因型分布行Hardy-Weinberg平衡检验的结果则与之相反，说明高分辨细化了实验结果，如使用HLA高分辨基因型验证人群是否处于遗传不平衡状态，须获得更多的HLA数据支持。有学者以超过12000例骨髓库标本的数据研究[11]，其统计学分析表明，以该研究样本数求单体型频率，在单体型频率低于0.000123时结果不一定可靠，唯一的解决之道是继续增加样本数，我们仅对1927份标本的高分辨结果进行H-W平衡检验，样本量低应为最主要原因。

本研究对Flow-SSO结果模棱两可者行SBT检测，发现二者在中低分辨结果上吻合性相当好，显示出Flow-SSO法为大批量标本HLA检测的可行性方法。本研究还提示HLA配型实验室除应加强质量控制外，应至少建立两种HLA方法或常备两种以上HLA分型试剂．以便相互验证，同时证明PCR-SBT为HLA检测之金标准。

有学者认为[11],评估干细胞资料库质量和效益主要考虑两个因素，供者HLA分型的准确性和初次查询中病人配到HLA匹配供者的机会。根据人群特点，得出本地区干细胞资料库HLA三座位单体型频率数据，将有利于快速计算在骨髓库中发现匹配供者的概率，评估骨髓库供者的数量和民族背景的组成是否适用于临床需要，对于制定长远的骨髓库发展计划大有裨益。

[1]Robinson J,Malik A,Parham P,et al.IMGT／HLA Sequence Database-a sequence database for the human major histocompatibility complex[J]．Tissue Antigens,2000,55(3)∶280-287.

[2]Shi L,Shi L,Yao YF,et al.Genetic link among Hani,Bulang and other Southeast Asian populations：evidence from HLA-A，-B，-C，-DRBl genes and haplotypes distribution[J]．Int J Immunogenet, 2010,37∶467-475．

[3]Excoffier L，Lischer HE．Arlequin suite vet 3.5：a new series of programs to perform population genetics analysis under Linux and Windows[J]．Mol Ecol Resour,2010,10(3)∶564-567．

[4]Trachtenberg E,Vinson M,Hayes E,et al.HLA class I(A,B,C) and classⅡ(DRB 1,DQA1,DQB1,DPB 1)alleles and haplotypes in the Han from southern China[J].Tissue Antigens,2007,70(6)∶455-463.

[5]Leffell MS,Fallin MD,Hildebrand WH,et al.HLA alleles and haplotypes among the Lakota Sioux∶report of the ASHI minority workshops,PartⅢ[J].Hum Immunol,2004,65(1)∶78-89.

[6]张毅,庄云龙,聂向民,等.山东省烟台和威海地区汉族HLA-A、B和DRB等位基因多态性及遗传距离分析[J].中华医学遗传学杂志,2012,29(2)∶229-233.

[7]赵桐茂.寻找HLA匹配无关供者概率曲线的计算及应用[J].中国输血杂志.2003,16(6)∶381-384.

[8]李国良,肖莉,孙瑜,等.江西地区汉族人群HLA-I类抗原分布[J].江西医学检验,2006,24(3)∶215-216.

[9]李国良,孙瑜,肖莉,等.江西地区汉族人群HLA-DR基因多态性的分布特征[J].江西医学院学报,2006,46(4),125-128.

[10]丁浩强,叶欣,梁华钦,等.广州地区献血人群HLA-A、B、DRB1高分辨等位基因及单体型多态性的研究[J].中国免疫学杂志, 2010,26(9)∶810-813.

[11]孙继丽,杜可明,傅敏,等,HLA-A，B，DRB1单体型频率计算及其在骨髓库中的应用[J].中国输血杂志,2005,18(4)∶280-285.

Analysis of HLA-A，B，and DRBl polymorphism of 1927 bone marrow donors in Jiangxi

SUN Yu,PENG Jihong,LI Guo-Liang.HLA Laboratory,Jiangxi Blood Center，Nanchang 330077,P．R．China

Objective To investigate allelic and haplotypic polymorphisms of human leukocyte antigen(HLA)genes at A，B and DRBl loci in native Han population of Jiangxi.Methods A total of 1927 unrelated Han ethnic individuals from Jiangxi regions were genotyped by Flow-sequence specific olignucleotide probe(Flow-SSO)and polymerase chain reaction-sequence-based typing(PCR-SBT)for HLA-A，B and DRBl loci.Allelic and haplotypic frequencies were estimated by maximum likelihood estimation method(EM)using Arlequin 3.5 software.Results A total of 17,29 and 12 alleles were observed at HLA-A，B and DRBl loci respectively.The most frequent alleles were A*02(0.3064),B*40(0.1889)and DRBl*9(0.1917).The most common haplotype was A*02-B*46-DRBl*09(0.0721).Conclusion The HLA-A，B and DRBl loci are highly polymorphic in native Han population of Jiangxi province.

Human leukocyte antigen(HLA)；Polymorphism；China Marrow Donor Program(CMDP)

R457.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0661-03

2014-09-30；

2014-11-05)

江西省科技支撑计划项目(编号：BSA13700)

孙瑜，女，出生于1976年11月，医学硕士，副主任技师，研究方向为免疫遗传学。

李国良，男，出生于1968年11月，医学硕士，主任医师，研究方向为免疫遗传学。