斑马鱼毒性检测方法的优化及应用研究

李志，黄俊明

(广东省疾病预防控制中心，广东广州510430)

·论著·

斑马鱼毒性检测方法的优化及应用研究

李志，黄俊明

(广东省疾病预防控制中心，广东广州510430)

目的通过优化斑马鱼急性毒性检测方法，检测和分析辅酶Q、低聚果糖、双酚A对斑马鱼的毒性作用，探讨其在食品安全性检测与评价中的应用前景。方法优化试验用斑马鱼的基本条件、非水溶性和水中溶解度较低的受试物的处理要求和斑马鱼急性毒性试验条件,观察和记录斑马鱼在不同浓度的辅酶Q、低聚果糖、双酚A的试验溶液中暴露48h的毒性反应和死亡情况，检测和分析不同浓度的辅酶Q、低聚果糖、双酚A对斑马鱼的毒性作用。结果斑马鱼在剂量为100～1000mg/ L的辅酶Q试验溶液中饲养48h，未发现斑马鱼有任何毒性反应，辅酶Q对斑马鱼的48hLC50为大于1000mg/L；斑马鱼在剂量为100～1000mg/L的低聚果糖试验溶液中饲养48h，未发现斑马鱼有任何毒性反应，低聚果糖对斑马鱼的48hLC50为大于1000mg/L；斑马鱼在剂量为10mg/L的双酚A试验溶液饲养3h后开始出现毒性反应，在剂量为8mg/L的双酚A试验溶液饲养6h后开始出现毒性反应，在剂量为6mg/L的双酚A试验溶液饲养12h后开始出现毒性反应，双酚A对斑马鱼的48hLC50为7.15mg/L。结论本研究显示优化的斑马鱼急性毒性检测方法能够快速检测食品和食品污染物的急性毒性，其在食品安全性检测与评价中将有较好应用前景。

斑马鱼；急性毒性；双酚A；优化

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.003

近年来，三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精、塑化剂等食品安全事件的不断涌现，食品安全问题无疑已成为民生问题中的重中之重。如何以已发生的食品安全事件为鉴，为人民群众的饮食安全提供更好的保障已成为摆在我们面前的重大课题，如何建立快速、有效的毒性检测方法，加强食品安全相关检测和评价，已成为了目前最需要迫切解决的问题。

斑马鱼(zebrafish),又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼,属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼，是脊椎动物，具有近似人类的各种器官系统，采用斑马鱼作为实验动物，与大、小鼠等实验动物相比具有较强的优势，而且以水生动物代替啮齿类实验动物可能是较好推动动物替代的方法之一。国际标准化组织在20世纪80年代推荐斑马鱼为毒性试验的标准实验用鱼，目前斑马鱼已经列为健康毒性和环境毒性检测实验的标准鱼类,试验得出的数据可以在国际上认证[1]。

目前在我国尚无以斑马鱼模式动物为实验动物进行食品安全性检测与评价的检测方法，虽然斑马鱼模式动物为搭建快速、有效的毒性检测技术平台提供了良好实验动物基础，但要将斑马鱼毒性检测方法作为标准方法应用于食品安全性检测与评价,还有待进一步完善和优化[2]。本研究拟优化试验用斑马鱼的基本条件、非水溶性和水中溶解度较低的受试物的处理要求和斑马鱼急性毒性试验条件，检测和分析辅酶Q、低聚果糖、双酚A对斑马鱼的毒性作用，探讨优化的斑马鱼急性毒性检测方法在食品安全性检测与评价中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鱼斑马鱼来源于南方医科大学，斑马鱼平均体长26.0±2mm，平均体重0.26±0.11g。

1.1.2 试剂二甲基亚砜(美国sigma)，辅酶Q(某生产厂家提供)，低聚果糖(某生产厂家提供),双酚A (美国sigma)，标准稀释水(按照GB 13267-91来配制)。

1.2 方法

1.2.1 试验用斑马鱼的基本条件试验鱼种应是斑马担尼鱼(真骨鱼总目，鲤科)，试验鱼应无明显的疾病和肉眼可见的畸形，试验鱼试验前两周内不应对其做疾病处理，试验鱼试验前应在与试验时相同的环境条件下驯养3周，驯养期间死亡率不得超过10%，如果超过10%，则该批鱼不得用作试验。试验鱼试验前24h停止喂饲，试验鱼宜选择体长30±5mm、体重0.3±0.1g健康且个体差异不大且同一鱼群的斑马鱼[1，2]。

1.2.2 非水溶性和水中溶解度较低的受试物的处理要求试验当天配制受试物试验溶液，水溶性受试物可溶于一定体积的标准稀释水、去离于水或蒸馏水中；水中溶解度较低受试物，可使用超声波装置助溶或在不破坏受试物的温度下加热助溶；非水溶性的受试物，可使用少量对鱼低毒的有机溶剂(二甲基亚砜等)助溶后再使用标准稀释水将其配置成溶液，但有机溶剂在试验溶液中的浓度不应超过0.1mg／L，并应同时进行两组对照试验，一组含有的溶剂为全部试验溶液中的最高浓度，另一组则不含溶剂或试验物质的标准稀释水[3，4]。

1.2.3 斑马鱼急性毒性试验条件试验鱼缸一般选择5L容积的玻璃鱼缸，使用前应清洗干净并装满纯净水浸泡48h，使用前倒掉鱼缸中的纯净水并用标准稀释水润洗后装入4L新配制的标准稀释水(pH为7.4±0.2，温度为23±1℃，硬度为250㎎/L左右),曝气至溶解氧浓度达到空气饱和值供试验用，标准稀释水中溶解氧应不少于4mg/L。实验时，注意保持鱼缸每天光照与黑暗的时间比为16∶8，光照度1000 Lux，鱼缸内水温为23±1℃，pH稳定在7.4±0.2[5]。

1.2.4 受试物剂量选择和试验溶液配制根据预实验，辅酶Q设100、200、400、600、800、1000mg/L共6个剂量组和2个对照组(溶剂对照组和空白对照组)，辅酶Q先用二甲基亚砜助溶后再用标准稀释水按所设浓度分别配置1L试验溶液(5倍浓度)供试验用，溶剂对照组的试验溶液按二甲基亚砜的最高使用浓度配置，空白对照组的试验溶液直接使用标准稀释水。低聚果糖设100、200、400、600、800、1000mg/L共6个剂量组和2个对照组(溶剂对照组和空白对照组)，低聚果糖先用少量蒸馏水溶解后再用标准稀释水按所设浓度分别配置1L试验溶液(5倍浓度)供试验用，溶剂对照组的试验溶液按蒸馏水的最高使用浓度配置，空白对照组的试验溶液直接使用标准稀释水。双酚A设1、2、4、6、8、10mg/L共6个剂量组和2个对照组(溶剂对照组和空白对照组)，双酚A先用二甲基亚砜助溶后再用标准稀释水按所设浓度分别配置1L试验溶液(5倍浓度)供试验用，溶剂对照组的试验溶液按二甲基亚砜的最高使用浓度配置，空白对照组的试验溶液直接使用标准稀释水。

1.2.5 斑马鱼急性毒性试验方法将受试物辅酶Q、低聚果糖、双酚A配制好试验溶液(5倍浓度)后，实验时分别将各剂量组和对照组的试验溶液加入到已备好的5L鱼缸中，并将1L试验溶液(5倍浓度)和鱼缸中的4L标准溶液充分混匀。选择个体差异不大的健康斑马鱼在每个5L鱼缸中投入10条，整个试验期间不喂食，试验过程中分别观察每个鱼缸中斑马鱼的反应情况，并记录有异常反应的斑马鱼的具体反应情况。斑马鱼的中毒反应表现为时而窜动、反应迟钝、游动能力下降、身体沉底、失去平衡、侧翻、身体弯曲、身体畸形、躺卧死亡等，如果斑马鱼没有任何的生存迹象，如鳃的扇动，碰触鱼后也无反应，即可判断该鱼死亡，发现斑马鱼死亡时要及时捞出死亡个体，并记录死亡时间。实验结束后，根据得到的各组死亡情况，统计各组死亡率。采用寇氏法计算受试物对斑马鱼的LC50，计算公式为lgLC50=Xm-i(∑p－0.5)，式中Xm为死亡组最大剂量的对数，i为相邻两组剂量对数之差，p为各组某一时间点的死亡率，∑p为各组某一时间点的死亡率之和[5]。受试物对斑马鱼的LC50采用用48hLC50表示结果，并根据“GB/T 21281-2007危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法”进行评价。

2 结果

2.1 辅酶Q对斑马鱼的毒性作用情况斑马鱼在剂量为100mg/L～1000mg/L的辅酶Q、溶剂对照组和空白对照组的试验溶液中饲养48h，未发现斑马鱼有任何毒性反应，辅酶Q对斑马鱼的48hLC50为大于1000mg/L。

2.2 低聚果糖对斑马鱼的毒性作用情况斑马鱼在剂量为100mg/L～1000mg/L的低聚果糖、溶剂对照组和空白对照组的试验溶液中饲养48h，未发现斑马鱼有任何毒性反应，低聚果糖对斑马鱼的48hLC50为大于1000mg/L。

2.3 双酚A对斑马鱼的毒性作用情况斑马鱼在剂量为10mg/L的双酚A试验溶液饲养3h后开始出现毒性反应，在剂量为8mg/L的双酚A试验溶液饲养6h后开始出现毒性反应，在剂量为6mg/L的双酚A试验溶液饲养12h后开始出现毒性反应，斑马鱼的毒性反应初期表现为游动能力下降，反应比较迟钝等中毒症状，随着时间的延长中毒鱼出现失去平衡、侧翻，并慢慢丧失运动能力，随后出现身体弯曲、畸形，最后躺卧死亡。斑马鱼在剂量为1mg/L～4mg/L的双酚A、溶剂对照组和空白对照组的试验溶液中饲养48h，未发现斑马鱼有任何毒性反应。根据记录的各组斑马鱼死亡情况，计算各组斑马鱼死亡率，采用寇氏法计算出双酚A对斑马鱼的48hLC50为7.15mg/L。见图1。

图1 双酚A对斑马鱼的毒性作用情况

3 讨论

自20世纪70年代末，国外开始运用斑马鱼进行有毒化学物监测方面的研究，研究的化学物包括锌、镉、硒、汞等重金属以及苯酚、苯胺、环己胺等有机物[6]。近年来，斑马鱼模式动物在国内的江、河水体污染监测和控制等方面的应用逐渐受到研究机构的重视，很多国内研究者开展了激素、中药、有毒化学品等对斑马鱼毒性影响方面的研究，分析了其在检测判断污染物的毒性类型及潜在危害程度方面的特有优势，这些研究也为斑马鱼模式动物在多领域的拓展应用提供了很好的研究基础[7-9]。

人们一直以为日常生活环境中接触的双酚A浓度很低，不足以构成对人体的危害，在民间、厂商、官方之间一直久拖未决进行着“低剂量双酚A有害还是安全”的争论，但在“双酚A奶瓶事件”发生后，世界各国都对双酚A的毒性都极其重视，有研究表明[10-13]双酚A具有一定的毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生。本研究实验结果显示斑马鱼在剂量为10mg/ L的双酚A试验溶液饲养3h后开始出现毒性反应，在剂量为8mg/L的双酚A试验溶液饲养6h后开始出现毒性反应，在剂量为6mg/L的双酚A试验溶液饲养12h后开始出现毒性反应，但斑马鱼在剂量为1mg/L～4mg/L的双酚A的试验溶液、溶剂对照组和空白对照组的试验溶液中饲养48h，未发现斑马鱼有任何毒性反应。本研究结果与相关研究报道有较好的一致性[14，15]。

本研究通过完善和优化试验用斑马鱼的基本条件、非水溶性和水中溶解度较低的受试物的处理要求和斑马鱼急性毒性试验条件，使优化的斑马鱼急性毒性检测方法能够快速检测不同类别的食品和食品污染物的急性毒性作用，使该检测方法有了更广的应用范围和更趋于标准化。本研究对推动斑马鱼急性毒性检测方法的标准化应用提供了研究基础，对斑马鱼急性毒性检测方法作为食品安全应急检测技术的推广应用提供科学依据，该检测方法在食品安全性检测方面将有着广泛的应用前景。

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Optimization and application on the toxicity test method of zebrafish

LI Zhi，HUANG Junming.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 511430,China

Objective By optimizing the acute toxicity test method of zebrafish,the toxic effect of coenzyme Q,fructooligosaccharides(FOS)and bisphenol A on zebrafish were detected and analyzed,and to explore the application prospect of the method in food safety test and evaluation.Methods The basic state of zebrafish and the acute toxicity test conditions were optimized.Zebrafish were exposured to the solution containing different concentrations of coenzyme Q,FOS and bisphenol A for 48h,the zebrafish toxicity and mortality rate were observed,the toxic effect were detected.Results When zebrafish were fed in the test solution containing 100～1000mg/L coenzyme Q for 48h,no toxicity was found,the LC50of coenzyme Q in 48h was greater than 1000mg/L.While zebrafish were fed in the test solution containing 100～1000mg/L FOS for 48h,no toxicity was found,the LC50of FOS in 48h was greater than 1000mg/L.After zebrafish were fed in the test solution containing 10mg/L bisphenol A for 3h,containing 8mg/L bisphenol A for 6h，containing 6mg/L bisphenol A for 12h，the toxic reaction could be detected,the LC50of bisphenol A in 48h was 7.15mg/L.Conclusion This study showed that the optimized acute toxicity test method of zebrafish can be used as rapid detection method for the acute toxicity of food and food contaminants,and has a wide range of applications in the safety test and evaluation of food.

Zebrafish;Acute toxicity;Bisphenol A;Optimization

R155.5+5

A

1674-1129(2014)06-0658-03

2014-09-02；

2014-10-15)

广东省医学科学技术研究基金项目(编号：A2010058)

李志，男,1975年出生,副主任医师,本科,研究方向∶食品卫生。