兔退变椎间盘纤维环及髓核组织中的PG、MMP-3、TIMP-2表达变化及意义

刘 林，骆文远，张 超，宋玉鑫，舍 炜

(甘肃省人民医院骨二科，兰州 730000)

近年来研究发现，椎间盘基质的分解是椎间盘退变的一个主要特征，其中基质、胶原、蛋白多糖等是椎间盘的重要组成成分，并被椎间盘细胞产生的酶所降解。这些降解酶中最主要的是基质金属蛋白酶(MMPs)。其作用可表现为以下两个方面：翻译后对蛋白水解酶活性进行调节；激活酶类，通过和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)结合，进一步对MMPs进行调节[3]。但是，MMPs及TIMPs对椎间盘退变的影响尚不清楚。本实验拟在建立兔椎间盘退变模型的基础上，观察退变椎间盘组织纤维环和髓核中蛋白多糖(PG)、MMP-3和TIMP-2的表达变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6月龄普通级新西兰大白兔42只(影像学检查排除椎体先天性畸形和椎间盘病变)，体质量(2.5±0.5)kg，雌雄不限，分为实验组和对照组，各21只。选择直径110 mm、长70 cm的PVC管，将实验动物固定在PVC管中，实验组将PVC管直立，对照组将PVC管平放。将动物在管中连续固定5 h/d，建立椎间盘退变模型。经X线检查实验动物脊柱发生退变，证实建模成功。分别于建模后4、8、12周各取7只动物的L4～5椎间盘组织。10%甲醛溶液固定24 h，经脱钙、脱水处理后，行矢状位取材，石蜡包埋后切片。

1.2 PG的检测 用高碘酸-希夫(PAS)染色观察椎间盘中纤维环和髓核中的PG。PAS染色后细胞外基质中的PG呈紫红色[4]。随机从每组7张组织切片中选取1张，在×100视野下对纤维环和髓核随机选取5个不重复视野。采用Image-Pro Plus6.0软件进行分析处理，将灰度值阈值调为 0～255，以灰度值间接反映PG的相对含量(灰度值越高表明PG含量越低)。

1.3 MMP-3、TIMP-2的检测 采用免疫组化SP法。鼠抗兔MMP3单克隆抗体、鼠抗兔TIMP-2单克隆抗体购自艾美捷科技有限公司，免疫组化SP试剂盒购自迈新生物技术公司。取两组椎间盘组织，石蜡4 μm切片后常规脱蜡至水化，3%过氧化氢室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，微波修复抗原3 min后自然冷却，用正常羊血清工作液封闭10 min，加入一抗稀释液37 ℃孵育3 h后PBS冲洗 3次，添加用生物素标记的二抗37 ℃孵育15 min后PBS冲洗3次，添加辣根酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min后PBS洗3次，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，PBS冲洗返蓝，经梯度乙醇脱水干燥、透明中性树胶封片。从每组7张组织切片中随机选取1张，Olympus光学显微镜×400视野下对纤维环和髓核随机选取5个不重复视野拍摄照片，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件测定每张照片的平均光密度值(MOD) 。

2 结 果

2.1 建模不同时间两组椎间盘纤维环及髓核组织中PG的表达比较 髓核中染色呈紫红色的物质减少，经4、8、12周实验组和对照组相比较髓核的灰度值变化差异有统计学意义(P<0.05)，且实验组、对照组内各造模时间段(4、8、12周)髓核的灰度值变化差异也有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 经PAS染色实验组及对照组髓核和纤维环中PG 灰度值比较

a:P<0.05,与实验组纤维环平均灰度值相比较;b:P>0.05;c:P<0.05，与对照组纤维环平均灰度值比较。

2.2 MMP-3和TIMP-2在椎间盘中的表达情况 MMP-3 、TIMP-2阳性为细胞质见棕色颗粒(图1),在纤维环中(表2)，对照组中同一时间MMP-3和TIMP-2的平均MOD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；随着造模时间的延长实验组各时间段TIMP-2较MMP-3的平均MOD值差异明显(P<0.05)，其中在12周时平均MOD值差异有统计学意义(P<0.01)。在相同组别不同时间段比较，对照组中MMP-3的平均MOD值在8周时无明显差异(P>0.05)，在12周时平均MOD值较8周时发生明显变化(P<0.05)；TIMP-2的平均MOD值随着造模时间的延长变化明显，其中在8周时差异不明显(P<0.05)，在12周时差异明显(P<0.01)。实验组中MMP-3随着造模时间的延长MOD值逐渐增大(P<0.05)，而TIMP-2的平均MOD值在8周时相对4周无明显差异(P>0.05)，在12周时平均MOD值明显增大(P<0.05)。

A:TIMP-2蛋白；B:与MMP-3蛋白。

图1 髓核组织中TIM-P2与MMP3的表达(SP×400)表2 MMP-3、TIMP-2在实验组及对照组纤维环中 平均MOD值的变化比较

a：P<0.05，c:P<0.01，与实验组MMP-3平均MOD值比较;b：P>0.05，与对照组MMP-3平均MOD值比较。

在髓核中对MMP-3、TIMP-2比较平均MOD值(表3)表明，在对照组及实验组同一时间点MMP-3和TIMP-2的平均MOD值比较差异有统计学意义(P<0.05)。在相同组别不同时间段进行比较结果表明随着时间的延长，对照组MMP-3及TIMP-2的平均MOD值在8周时差异无统计学意义(P>0.05)，在12周时平均MOD值均增大明显(P<0.05)；实验组MMP-3及TIMP-2的平均MOD值差异有统计学意义(P<0.05)，且MMP-3在12周时平均MOD值增大差异明显(P<0.01)。

表3 MMP-3、TIMP-2在实验组及对照组髓核中平均 MOD值的变化比较

a：P<0.05，与实验组MMP-3比较；b：P<0.05，与对照组MMP-3比较。

3 讨 论

本研究考虑到手术中取出的人类椎间盘可能会破坏其完整性，故选择用动物模型来观察完整椎间盘纤维环和髓核退变中PG、MMP-3、TIMP-2的表达变化。通过本实验发现，在椎间盘的退变过程中早期髓核中PG的变化明显快于纤维环。且不论实验组还是对照组髓核组织中PG均较纤维环组织中变化明显。有研究表明，人类椎间盘退变早期改变表现为PG聚合体数量的减少以及髓核的脱水[6]，多种因素导致的椎间盘组织学中改变首先影响终板，其次是髓核，最后是纤维环[7]，本研究结果与以上研究结论相一致。

本研究发现，随着造模时间的延长，对照组及实验组同一时间点髓核中MMP-3的表达明显高于TIMP-2。且随着建模时间的延长实验组中MMP-3和TIMP-2的表达均增加明显。对照组同一时间点随着造模时间的延长纤维环中MMP-3和TIMP-2的平均MOD值比较差异无统计学意义(P>0.05)；实验组随着造模时间的延长各时间段TIMP-2较MMP-3的表达变化明显。该结果提示在椎间盘退变的过程中MMP-3和TIMP-2在椎间盘的纤维环和髓核中表达不同，其中MMP-3主要在髓核中表达，而TIMP-2主要在纤维环中表达。这可能和其所起的作用不同有关。髓核内细胞在胚胎为脊索样细胞，在健康成人主要以软骨样细胞为主，合成Ⅱ型胶原和PG。纤维环中为梭形的类成纤维细胞，主要合成Ⅰ型胶原。PG及核心蛋白的表达在髓核最高，由内向外逐渐减弱，在椎间盘退变过程中，PG逐渐被富含胶原组织的纤维组织所替代，最后导致髓核纤维化，水分随之丧失。而MMP-3作为一种基质降解酶，其作用底物范围广，其主要作用底物是基质中PG和糖蛋白[8]。MMP-2作为一种明胶酶，和胶原酶共同在纤维环中降解胶原，而TIMP-2在纤维环中的高表达，可能和TIMP-2在组织中可以1∶1以非共价键形式与活化的MMP-2形成复合物，有效地抑制MMP-2的胶原分解活性及明胶活性有关[9]。

因此，对MMP-3、TIMP-2在椎间盘退变中所起作用的研究结合髓核PG的变化可能会对临床诊断、基因治疗和组织工程技术的应用有一定帮助。但是细胞因子作为一种复杂的网络系统，还需要进一步深入研究其相互之间的作用机制。

[1]Paesold G,Nerlich AG,Boos N.Biological treatment strategies for disc degeneration:potentials and shortcomings[J].Eur Spine J,2007,16(4):447-468.

[2]Gomis-Rüth FX.Catalytic domain architecture of metzincin metalloproteases[J].J Biol Chem,2009,284(23):15353-15357.

[3]Stamenkovic I.Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis[J].Semin Cancer Biol,2000,10(6):415-433.

[4]董妙珠,肖萍,叶于薇,等.PAS、AB染色法在软骨蛋白黏多糖检测中的运用[J].上海预防医学,2004,16(9):419-420.

[5]于萍，步宏，王华，等.免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究[J].生物医学工程学杂志，2003，20(2):288-290.

[6]Nguyen AM,Johannessen W,Yoder JH,et al.Noninvasive quantification of human nucleus pulposus pressure with use of T1rho-weighted magnetic resonance imaging[J].J Bone Joint Surg Am,2008,90(4):796-802.

[7]Leung VY,Tam V,Chan D,et al.Tissue engineering for intervertebral disk degeneration[J].Orthop Clin North Am,2011,42(4):575-583.

[8]Roberts S,Caterson B,Menage J,et al.Matrix metalloproteinases and aggrecanase:their role in disorders of the human intervertebral disc[J].Spine,2000,25(23):3005-3013.

[9]Tim Yoon,Nilpesh M,Patel S.Molecular therapy of the intervertebral disc[J].Eur Spine J,2006,15 Suppl 3:S379-388.