AEG-1 siRNA对宫颈癌细胞株增殖和凋亡影响的研究

秦瑞英，王宏伟，赵建华，杨玉新，刘 颖，任艳芳

(新乡医学院第一附属医院：1.妇产科;2.感染疾病科;3.神经内科,河南卫辉 453100)

宫颈癌是一种最常见的女性恶性肿瘤，在发展中国家，其发病率和病死率在女性肿瘤中居第2位，且发病率以每年2%～3%的速度增长，严重威胁着女性的健康[1]。手术、放疗、化疗等作为妇科恶性肿瘤治疗的常规方法，对晚期患者疗效不佳，且不良反应多。小分子干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)是1998年Fire等通过对线虫的研究发现的一种RNA干扰技术，是目前医学上用来研究基因功能和基因治疗的最具潜力的工具之一[2]。自2002年Su等克隆出星形细胞上调基因1( astrocyte elevated gene-1,AEG-1)以来，该基因在肿瘤研究领域日益引起人们的重视。近年研究表明，AEG-1基因与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关[3]。因此本研究在体外通过脂质体将AEG-1 siRNA转染宫颈癌细胞，研究AEG-1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响，为以AEG-1为靶点的宫颈癌基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 宫颈癌细胞株SiHa购自中国典型培养物保藏中心。DMEM培养液、胰酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司；AEG-1 siRNA和对照siRNA均购自美国Zymed公司；总RNA提取试剂Trizol、RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；Annexin V凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司。

1.2 细胞培养、转染及分组 宫颈癌细胞株SiHa细胞复苏后置于含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中培养，当细胞传代到细胞状态稳定后，以1×106cells/well细胞接种于6孔培养板，待细胞长至90%融合度时，将AEG-1 siRNA和对照siRNA采用脂质体介导法转染至SiHa细胞(操作严格按照说明书进行)。转染后细胞分为3组：空白对照组(不作任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和AEG-1 siRNA组(AEG-1 siRNA转染)。

1.3 荧光定量RT-PCR检测 收集转染后48 h的3组宫颈癌SiHa细胞，细胞总RNA提取采取Trizol一步提取法。逆转录成cDNA。AEG-1上游引物：5′-GGC AAT TGG GTA GAC GAA GA-3′，下游引物：5′-CCT GTT TTC GAC GGG TTT TA-3′。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。用比较阈值法来测定目的基因的相对表达量。

1.4 细胞生长曲线检测 收集转染48 h后的3组宫颈癌SiHa细胞，用含10%FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔2 000个细胞接种于96孔培养板，每孔体积200 μL，培养1 d后细胞达到80%融合度。不同时间点(4、24、48、72 h)倒出细胞培养液，每孔加入含MTT溶液(5 g/L)10 μL的新鲜培养液100 μL，继续孵育4 h，终止培养，加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪(490 nm)上调定各孔吸光度值，测定结果。以空白对照组调零，实验重复3次。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集转染48 h后的3组宫颈癌SiHa细胞，用4 ℃预冷的PBS漂洗细胞2次，250 μL 1×binding buffer重悬细胞制备成单细胞悬液，调节浓度为1×106cells/L。取100 μL细胞悬液于流式管中，加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL PI，混匀后室温避光孵育15 min，加入400 μL PBS，上机检测(按照试剂盒说明书进行)。

1.6 细胞周期分析 收集转染48 h后的3组宫颈癌SiHa细胞，每组细胞数为1×106个。1 000 r/min离心5 min，PBS漂洗细胞3次，4 ℃ 70%预冷乙醇固定30 min，预冷PBS漂洗3次，1 000 r/min离心5 min，重悬细胞于含1 mL PI的PBS溶液中，避光孵育30 min上机检测，采用Modifit软件分析细胞周期。

2 结 果

2.1 宫颈癌SiHa细胞AEG-1 mRNA表达 采用荧光定量RT-PCR检测宫颈癌SiHa细胞AEG-1 mRNA表达。结果表明：AEG-1 siRNA组AEG-1 mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组和阴性对照组AEG-1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 AEG-1 mRNA相对表达分析

2.2 AEG-1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响 MTT法检测细胞生长曲线，结果显示：AEG-1 siRNA组SiHa细胞增殖较空白对照组和阴性对照组均明显减慢。72 h时AEG-1 siRNA组SiHa细胞吸光度值与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照组与空白对照组SiHa细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3 AEG-1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测宫颈癌SiHa细胞凋亡，结果显示：AEG-1 siRNA组SiHa细胞凋亡率[(17.4±4.3)%]明显高于空白对照组[(4.5±1.3)%]和阴性对照组[(5.2±1.8)%]，差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照组与空白对照组SiHa细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.4 AEG-1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞周期的影响 流式细胞术分析SiHa细胞周期变化，结果显示：AEG-1 siRNA组SiHa细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比率[(59.23±1.05)%]明显高于空白对照组[(42.88±1.33)%]和阴性对照组[(43.13±0.88)%]，合成期(S)细胞比率[(26.46±0.87)%]显著低于空白对照组[(32.59±1.19)%]和阴性对照组[(31.83±1.11)%]，合成后期(G2/M)细胞比率[(14.30±0.46)%]显著低于空白对照组[(24.53±0.31)%]和阴性对照组[(25.03±0.68)%]，见图4。

图2 MTT法检测AEG-1 siRNA对宫颈癌SiHa

图3 流式细胞术检测宫颈癌SiHa凋亡率

图4 AEG-1表达下调对宫颈癌SiHa细胞周期的影响

3 讨 论

宫颈癌是影响女性健康最重要的疾病之一，在年轻女性中的发病率近年有明显的上升趋势，日益引起人们的关注和重视。近年来，通过对癌基因及抑癌基因的深入研究，宫颈癌的发生、发展及治疗的研究已进入基因水平。RNA干扰( RNA interference，RNAi)是利用碱基互补原理，通过导入双链RNA(double strands RNA，dsRNA)阻断同源基因的表达促使其mRNA降解，从而诱导该细胞目的基因功能丧失或出现特定基因缺失的表型。RNAi作为一种新的基因阻断技术，具有高效、特异、操作简便等优点[4]，是传统基因敲除技术和反义技术所无法比拟的。目前，RNAi对肿瘤进行基因治疗主要集中在肿瘤发生和肿瘤转移相关基因(如癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因)，以及与肿瘤耐药基因、细胞凋亡、信号转导、有丝分裂有关的基因方面[5]。在体外培养细胞及建立的动物模型中，利用RNAi技术治疗肿瘤取得了令人满意的效果。虽然目前RNAi技术应用于临床还有一定的距离，但有理由相信随着对RNAi机制的深入研究和RNAi技术的不断完善，肿瘤基因治疗的目标终究会实现。

AEG-1基因最初是在人类免疫缺陷病毒(HIV)-1感染的人胎儿星形细胞中被鉴定发现的[6]。2004～2005年，多个实验室先后克隆出AEG-1 cDNA 序列，其全长3 611 bp，含11个内含子和12个外显子，位于8q22，此区域是乳腺癌等多种癌症高度相关地带[7]。进一步研究显示，作为肿瘤发生发展过程中的一个关键基因，AEG-1通过不同的信号转导途径如PI3K-AKT、NF-κB、MAPK和Wnt等[8]，与肿瘤进展的几个关键方面，包括转化、增殖、细胞的存活、逃避细胞凋亡、迁移和侵袭、转移、血管生成及耐药等多种细胞生物学过程密切相关[9]。且被证实在多种肿瘤组织和体外培养的细胞中过度表达，如舌癌、前列腺癌、神经系统肿瘤、淋巴细胞癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌[10-15]等。

本实验用siRNA下调人宫颈癌细胞株中AEG-1基因表达，通过检测AEG-1基因下调宫颈癌细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学特性的影响，研究探讨AEG-1在宫颈癌发生、发展中的作用。结果显示通过下调AEG-1表达，可以显著降低宫颈癌细胞的增殖能力，同时，随着AEG-1表达下降，宫颈癌细胞的凋亡率明显增加，说明AEG-1在宫颈癌细胞的增殖和凋亡过程中起了重要作用。细胞周期检测结果也提示AEG-1表达下调后，更多的细胞阻滞在G0/G1期，处于增殖旺盛期的细胞比例明显减少。研究结果提示AEG-1在宫颈癌的发生、发展中可能起了重要作用，而利用RNA干扰技术可以下调AEG-1的异常高表达，在一定程度上阻滞宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡，可能为宫颈癌的基因治疗提供新的思路。

[1]Menczer J.Patient-tailored conservative surgical treatment of invasive uterine cervical squamous cell carcinoma[J].Minerva Ginecol,2013,65(4):407-415.

[2]Shibata MA,Shibata E,Morimoto J,et al.Therapy with siRNA for Vegf-c but Not for Vegf-d suppresses wide-spectrum organ metastasis in an immunocompetent xenograft model of metastatic mammary cancer[J].Anticancer Res,2013,33(10):4237-4247.

[3]Liu B,Wu Y,Peng D.Astrocyte elevated gene-1 regulates osteosarcoma cell invasion and chemoresistance via endothelin-1/endothelin A receptor signaling[J].Oncol Lett,2013,5(2):505-510.

[4]Amberkar S,Kiani NA,Bartenschlager R,et al.High-throughput RNA interference screens integrative analysis:Towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay[J].World J Virol,2013,2(2):18-31.

[5]田瑞敏,鄢佳程,王含彦,等.RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究现状[J].重庆医学,2013,42(7):811-814.

[6]Su ZZ,Kang DC,Chen Y,et al.Identification and cloning of human astrocyte genes displaying elevated expression after infection with HIV-1 or exposure to HIV-1 envelope glycoprotein by rapid subtraction hybridization,RaSH[J].Oncogene,2002,21(22):3592-3602.

[7]Dompe N,Rivers CS,Li L,et al.A whole-genome RNAi screen identifies an 8q22 gene cluster that inhibits death receptor-mediated apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(43):E943-951.

[8]Lee SG,Kang DC,DeSalle R,et al.AEG-1/MTDH/LYRIC,the beginning:initial cloning,structure,expression profile,and regulation of expression[J].Adv Cancer Res,2013(120):1-38.

[9]Emdad L,Das SK,Dasgupta S,et al.AEG-1/MTDH/LYRIC:signaling pathways,downstream genes,interacting proteins,and regulation of tumor angiogenesis[J].Adv Cancer Res,2013(120):75-111.

[10]Ke ZF,He S,Li S,et al.Expression characteristics of astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) in tongue carcinoma and its correlation with poor prognosis[J].Cancer Epidemiol,2013,37(2):179-185.

[11]Erdem H,Yildirim U,Uzunlar AK,et al.Relationship among expression of basic-fibroblast growth factor,MTDH/astrocyte elevated gene-1,adenomatous polyposis coli,matrix metalloproteinase 9,and COX-2 markers with prognostic factors in prostate carcinomas[J].Niger J Clin Pract,2013,16(4):418-423.

[12]Noch EK,Khalili K.The role of AEG-1/MTDH/LYRIC in the pathogenesis of central nervous system disease[J].Adv Cancer Res,2013(120):159-192.

[13]Yan J,Zhang M,Chen Q,et al.Expression of AEG-1 in human T-cell lymphoma enhances the risk of progression[J].Oncol Rep,2012,28(6):2107-2114.

[14]Srivastava J,Siddiq A,Emdad L,et al.Astrocyte elevated gene-1 promotes hepatocarcinogenesis:novel insights from a mouse model[J].Hepatology,2012,56(5):1782-1791.

[15]Zhang F,Yang Q,Meng F,et al.Astrocyte elevated gene-1 interacts with β-catenin and increases migration and invasion of colorectal carcinoma[J].Mol Carcinog,2013,52(8):603-610.