小青龙汤对哮喘小鼠气道变应性炎症作用的研究*

吴 奎，王 彦，毕玉田，肖贞良

(1.成都军区总医院呼吸内科，成都 610083；2.第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038；3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所呼吸内科，重庆 400042)

支气管哮喘是一种常见的由Th2细胞介导的、对变应原免疫耐受缺陷的疾病。哮喘患者在接触变应原时，调节性T细胞对Th2反应的调节作用减弱，使得CD4 T发生Th2偏移，从而分泌产生大量的白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-9、IL-13等Th2型细胞因子，诱导产生气道变应性炎症、黏液分泌增加、气道平滑肌痉挛，长期反复发作，甚至引起气道重建，导致气道狭窄，使患者出现喘息、呼吸困难等症状[1-2]。

哮喘的治疗主要是依据世界卫生组织制定的《哮喘全球创议》与中华医学会呼吸病学分会制定的《支气管哮喘防治指南》进行。这两份指南大同小异，其治疗的主要药物都是吸入的糖皮质激素与长效β2肾上腺素受体激素的复方制剂。根据这两份指南进行治疗，大部分患者可以得到较好的控制，然而，临床应用中往往遇到各种问题，特别是在经济较不发达的地区。由于经济问题，患者往往难以长期用药；且患者对吸入激素也存在顾虑，使得我国的哮喘控制水平极低，大部分患者未能得到很好的治疗。

中医药是我国的传统医疗方法，很早就已经应用于哮喘的治疗。中医传统理论认为，外寒内饮是哮喘的基本病因，患者外感风寒之邪，内伤生冷，或素体阳虚，寒痰内伏，易引动伏邪壅阻肺气，宣降失职，气道受阻，则咳嗽气喘。小青龙汤出自张仲景《伤寒论》，由麻黄、桂枝、芍药、细辛、干姜、灸甘草、五味子、半夏等8味中药组成。《伤寒论》：“伤寒表不解，心下有水气，干呕，发热而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利，少腹满，或喘者，小青龙汤主之。……心下有水气，咳而微喘，发热不渴者，小青龙汤主之。……小青龙汤，治咳逆倚息不得卧”。长期以来，小青龙汤已经应用于支气管哮喘的治疗，并取得良好疗效[3-4]。然而，小青龙汤对哮喘过程中免疫学功能的影响仍不清楚。本研究观察小青龙汤对哮喘小鼠模型肺部变应性炎症的作用，并检测了此过程中Th1、Th2与调节性T细胞的变化，旨在初步明确小青龙汤的作用，为深入探讨小青龙汤的作用机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～10周雌性BALB/c小鼠，体质量20.2 g，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。动物分为正常对照组(对照组)、OVA致敏/激发组(哮喘组)、小青龙汤治疗组(治疗组)，各8只。

1.2 仪器与试剂 纯化尘卵蛋白(OVA,grade V)购自美国Sigma公司。IL-4、IL-5、干扰素(IFN)-γ、IL-10 ELISA检测试剂盒购自美国BD公司。荧光标记的Foxp3、CD4、CD25抗体及同型对照抗体购自美国eBioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 致敏及激发步骤 分别于第1、15天腹腔注射含有80 μg卵蛋白的生理盐水溶液100 μL与等体积的铝佐剂的混合物，于第25～27天每天定时雾化吸入1%卵蛋白-生理盐水溶液30 min，雾化器产雾量为0.5 mL/min。对照组致敏及激发步骤同哮喘组，每次注射相同体积的生理盐水，雾化吸入生理盐水。在激发期间，治疗组小鼠以小青龙汤煎剂代替每日饮水。

1.3.2 小青龙汤制备 参照许济群主编《方剂学》制备：麻黄(去节)9 g，芍药9 g，细辛3 g，干姜3 g，炙甘草6 g，桂枝(去皮)6 g，半夏9 g(洗)，精确称取传统饮片，加水200 mL浸泡15 min，大火煎沸后小火煎30 min，趁热过滤，药渣再加500 mL水，煎20 min，趁热过滤，合并两次煎液，浓缩至500 mL，4 ℃保存备用。

1.3.3 支气管肺泡灌洗和取血 在第28天(最后1次雾化吸入激发后24 h)，小鼠以0.3%戊巴比妥0.3 mL腹腔注射麻醉后，眼眶取血，保存在肝素抗凝管内，常温下5 000 r/min离心5 min，血清移至另一干净Eppendorf管，-20 ℃保存待测。再切开气管行气管插管，以0.2 mL PBS灌洗2次，灌洗液回收率大于80%。

1.3.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数和分类计数 常温下1 500 r/min离心BALF 10 min，收集上清液，用以测定IL-4、IL-5和干扰素(IFN)-γ。细胞沉淀用0.1 mL PBS重悬，取少许进行细胞计数。其余细胞沉淀再次离心后，弃上清液，用少许PBS重悬后涂片，晾干后进行瑞氏染色。光学显微镜下计数500个非鳞状上皮细胞，并进行嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数，计算所占的百分比。

1.3.5 细胞因子检测 IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的检测方法参照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.6 流式细胞学检测 将前分离所得的外周血沉淀部分以1.5 mL PBS重悬，再以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液，使之悬于细胞悬液的上层，2 000 r/min离心20 min。取出试管，轻轻吸取液相交界的细胞，加入Hanks液3 mL，混匀后1 500 r/min离心5 min。去上清液，细胞加入完全培养基，将细胞浓度调整为2×106/mL，根据说明书将细胞以相关抗体标记后，用流式细胞仪检测Foxp3+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例。BALF细胞浓度调整为2×106/mL，根据说明书将细胞以相关抗体标记后，用流式细胞仪检测Foxp3+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例。

2 结 果

2.1 BALF细胞学改变 哮喘组的肺部表现以嗜酸性粒细胞气道炎症为特征，同时有多种炎性细胞的浸润，经小青龙汤治疗后，肺部炎性浸润明显减轻(图1)。结果表明，哮喘组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例显著增加，同时细胞总数及各类炎性细胞数量也显著增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。而治疗组小鼠BALF中细胞总数、细胞分类计数均较哮喘组显著下降，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

A：哮喘组；B：治疗组；C：对照组。

图1 3组小鼠肺部病理切片表1 小鼠BALF中细胞总数和分类计数的 变化

*：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.01，与哮喘组比较。

2.3 BALF和血浆中IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的水平 为判断小青龙汤对Th2型偏移的作用，本研究检测了BALF和血浆中IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-10的水平。结果表明：哮喘组小鼠外周血血浆中IL-4、IL-5水平显著高于对照组 (P<0.01)，IFN-γ的水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而IL-10水平显著低于对照组(P<0.01)，经小青龙汤治疗后，IL-4、IL-5、IL-10水平显著升高，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；各组IFN-γ水平差异均无统计学意义(P>0.05)。BALF中各细胞因子出现类似表现(表2、3)。

2.4 BALF中CD4+T细胞亚型的变化 流式细胞仪检测结果表明，哮喘组小鼠外周血中Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例显著低于对照组，治疗组Foxp3+T细胞比例与对照组水平无显著差异；在BALF中，哮喘组Foxp3+T细胞比例低于对照组，而治疗组BALF中的Foxp3+T细胞的比例显著高于哮喘组，甚至高于对照组(表4)。

表2 小鼠外周血的IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ水平

*：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.01，与哮喘组比较。

表3 小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ水平

*：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.01，与哮喘组比较。

表4 小鼠外周血与BALF中CD4+T细胞中Foxp3+ T细胞比例的变化

*:P<0.01，与对照组比较；#:P<0.01，与哮喘组比较。

3 讨 论

在本研究中，作者发现小青龙汤可以有效抑制卵蛋白诱导的肺部变应性炎症，减少炎性细胞在肺部的募集，降低肺泡灌洗中Th2型细胞因子水平，升高调节性细胞因子IL-10的水平，并且诱导Foxp3+调节性T细胞产生。

调节性T细胞可以分为天然调节性T细胞(nature occurring regulatory T cells,nTregs)和诱导性调节性T细胞(inducible regulatory T cells,iTregs)，而IL-10是这两种细胞发挥作用的重要介质。调节性T细胞数量减少及功能低下时对Th2偏移的调控减弱，是哮喘发生、发展的重要机制[5-7]；而哮喘的自然缓解也依赖于调节性T细胞的产生及IL-10的分泌[8]。作为治疗哮喘的经典抗炎药物，吸入性糖皮质激素也是通过诱导调节性T细胞的增加而发挥作用[9]。过敏原特异性免疫治疗(脱敏疗法)作为惟一有可能改变哮喘患者免疫反应并根治哮喘的方法，诱导调节性T细胞的产生及功能恢复，也是其作用机制之一[10]。而Mays等[11]的研究表明，在肺部通过外源性的方法使Foxp3表达增强，可以抑制变应原诱导的Th2型免疫反应。

小青龙汤已经应用于支气管哮喘的治疗，主要用于表寒里饮，寒象较重者。日本学者对本方在治疗哮喘方面的作用非常重视，对其作用机制的研究极为深入。体外研究表明，小青龙汤能抑制组胺释放和肥大细胞脱颗粒、Eos增殖、嗜碱性粒细胞的生长和分化、外周血单个核细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的合成，以及支气管平滑肌收缩。动物模型表明，小青龙汤可以降低气道高反应性[12]。进一步研究表明，小青龙汤降低了Th2细胞相关的细胞因子IL-4和IL-5的产生[13]；在OVA诱发的哮喘模型中，小青龙汤还使得OVA特异性IgE抗体水平下降[14]。

本研究发现，小青龙汤可以有效地抑制哮喘小鼠肺部变应性炎症，降低Th2型细胞因子的分泌，还可以诱导调节性细胞因子IL-10的分泌增加，升高Foxp3+CD4+T细胞的比例，这与调节性T细胞及IL-10在哮喘发病机制中的重要作用相符。因此，作者推测，小青龙汤可能是通过诱导IL-10和Foxp3的表达，进而诱导分泌IL-10的Th1和表达Foxp3的Treg细胞产生，进而抑制变应原诱导的Th2型免疫反应。

[1]Siegle JS,Hansbro N,Dong C,et al.Blocking induction of T helper type 2 responses prevents development of disease in a model of childhood asthma[J].Clin Exp Immunol,2011,165(1):19-28.

[2]Yamamoto Y,Negoro T,Hoshi A,et al.Impaired Ca2+regulation of CD4+CD25+regulatory T cells from pediatric asthm[J].Int Arch Allergy Immunol,2011,156(2):148-158.

[3]许艺芝.小青龙汤治疗支气管哮喘急性发作的临床研究[J].中医临床研究,2011，3(15):22-23.

[4]陈家卫.小青龙汤改善哮喘患者生存质量的疗效观察[J].福建中医药,2011,42(2):13-14.

[5]Kinoshita T,Baatjes A,Smith SG,et al.Natural regulatory T cells in isolated early responders compared with dual responders with allergic asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2014,133(3):696-703.

[6]Josefowicz SZ,Niec RE,Kim HY,et al.Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation[J].Nature,2012,482(7385):395-399.

[7]Stelmaszczyk-Emmel A,Zawadzka-Krajewska A,Szypowska A,et al.Frequency and activation of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in peripheral blood from children with atopic allergy[J].Int Arch Allergy Immunol,2013,162(1):16-24.

[8]Leech MD,Benson RA,De Vries A,et al.Resolution of Der p1-induced allergic airway inflammation is dependent on CD4+CD25+Foxp3+regulatory cells[J].J Immunol,2007,179(10):7050-7058.

[9]Singh AM,Dahlberg P,Burmeister K,et al.Inhaled corticosteroid use is associated with increased circulating T regulatory cells in children with asthma[J].Clin Mol Allergy,2013,11(1):1.

[10]Qu,SY,Ou-Yang HF,He YL,et al.Der p 2 recombinant bacille Calmette-Guerin targets dendritic cells to inhibit allergic airway inflammation in a mouse model of asthma[J].Respiration,2013,85(1):49-58.

[11]Mays LE,Ammon-Treiber S,Mothes B,et al.Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10 dependent mechanism[J].J Clin Invest,2013,123(3):1216-1228.

[12]Shimada T,Kondoh M,Motonaga C,et al.Enhancement of anti-allergic effects mediated by the Kampo medicine Shoseiryuto (Xiao-Qing-Long-Tang in Chinese) with lysed Enterococcus faecalis FK-23 in mice[J].Asian Pac J Allergy Immunol,2010，28(1):59-66.

[13]罗文坤,黄肖玲,胡柱佳.小青龙汤治疗支气管哮喘急性发作期临床研究[J].中国中医药信息杂志,2011，18(3):16-18.

[14]罗丹冬,丘振文.小青龙汤对小鼠支气管哮喘模型气道炎症及细胞因子的影响[J].现代生物医学进展,2010，10(4):655-657.