树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞抗前列腺癌细胞的免疫效应

匡幼林，邓远忠，梁思敏，苟 欣

(重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆 400016)

前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤之一，近年来，我国前列腺癌发病率呈上升趋势，前列腺根治性切除术和放疗是治疗早期前列腺癌的有效手段。但对于局部进展期或有远处转移的前列腺癌患者，目前却没有令人满意的治疗方法[1]。众多研究表明肿瘤患者的免疫功能低下，肿瘤细胞可通过多种机制逃避机体的免疫系统识别[2]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，可以诱导抗肿瘤的细胞毒T淋巴细胞免疫反应。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced cells,CIK)是一种经多重细胞因子诱导的，增殖能力强、高效杀灭肿瘤细胞的免疫活性细胞。研究表明，DC和CIK联合使用，能提高肿瘤患者的T淋巴细胞免疫能力，达到抗肿瘤免疫的作用。同时，DC-CIK对很多肿瘤细胞的杀伤活性较相同条件下单纯CIK细胞明显增强[3]。本研究通过探讨DC-CIK体外作用于前列腺癌细胞的免疫效应，为前列腺癌免疫治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 重组人白细胞介素-2(rhIL-2)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)购自PeproTech公司，白细胞介素-12(IL-12)和IFN-γ ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司；CD3单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocynate，FITC)标记的抗人CD3抗体、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的CD8和CD56抗体均购自德国BD Pharmingen公司；CCK-8 购自日本同仁化学研究所；RPMI 1640和胎牛血清培养液购自Gibico公司；淋巴细胞分离液(Ficoll)购自中国医学科学院血液病研究所；人前列腺癌细胞株PC3购自中国科学院。

1.2 DC和CIK的体外诱导 采集健康志愿者的外周血80 mL左右，用淋巴细胞分离液分离并收集单个核细胞(PBMC)，再用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬，并调整细胞浓度为6×106/mL，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h。收获未贴壁的细胞，取部分重悬于含有1 000 U/mL IFN-γ的完全培养基中培养，24 h后添加500 U/mL的rhIL-2和50 ng/mL的CD3单克隆抗体，每隔3 d半量换液1次，培养第7天，收获CIK细胞；另取部分细胞培养于含有50 ng/mL CD3单克隆抗体的完全培养基，每隔3 d半量换液1次，培养第7天即为T细胞。将贴壁细胞用含有10 ng/mL的rhGM-CSF和10 ng/mL的rhIL-4完全培养基继续培养，隔天半量换液1次，培养第7天收获DC细胞。

1.3 DC-CIK共培养 收获培养第7天的DC，调整细胞浓度为1×106/mL，按1∶10的比例和CIK细胞共培养，用含500 U/mL的rhIL-2完全培养基隔天半量换液1次，共培养7 d。

1.4 IL-12 和 IFN-γ的检测 分别取培养第7天的DC组、DC-CIK组、DC-T组和CIK组培养上清液100 μL，按照IL-12和IFN-γ ELISA试剂盒的操作要求，分别检测各组培养上清液中的IL-12和IFN-γ含量。

1.5 FCM检测细胞表型 分别离心收集培养第7天的DC组、DC-CIK组、DC-T组和CIK组细胞，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗涤3次后，分别添加FITC标记的人CD3抗体及PE标记的CD8、CD56抗体，4 ℃避光孵育30 min后，流式细胞仪检测。

1.6 细胞毒效应检测 收集PC3细胞，调整细胞浓度至5×105/mL，并接种至96孔培养板中，作为检测细胞毒效应的靶细胞。分别取培养第7天的DC组、DC-CIK组、DC-T组和CIK组细胞，作为效应细胞。将效应细胞按10∶1、20∶1、50∶1接种到靶细胞孔中进行混合培养。24 h后，采用CCK-8法检测各孔吸光度值，按公式计算效应细胞对靶细胞的杀伤效应。杀伤活性(%)=[(靶细胞对照组A值-实验组A值)/靶细胞对照组A值]×100%。

2 结 果

2.1 IL-12 和 IFN-γ的检测 用IL-12和IFN-γ ELISA试剂盒分别检测细胞培养上清液中的IL-12和IFN-γ的浓度，结果表明：DC-CIK组细胞分泌的IL-12、IFN-γ浓度分别为(105.14±2.16)、(726.28±21.35)pg/mL，较DC组、DC-T组和CIK组均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 细胞表型分析 FCM分析显示：DC-CIK组、DC-T组和CIK组细胞均高表达CD3，差异无统计学意义(P>0.05)。DC-CIK组CD3+/CD56+和CD3+/CD8+细胞数分别为(27.80±1.01)%、(60.90±1.28)%，较DC-T组和CIK组均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 细胞毒效应评价 以PC3细胞为靶细胞，DC组、DC-CIK组、DC-T组和CIK组细胞分别作为效应细胞，CCK-8法检测淋巴细胞杀伤效应。结果显示：DC-CIK组细胞对PC3细胞产生高细胞杀伤率(52.31±2.14)%，相比DC组(11.14±1.02)%、DC-T组(14.19±1.63)%和CIK组(34.43±2.01)%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

表1 ELISA检测细胞培养上清液中IL-12和IFN-γ 的浓度

*：P<0.05,与DC、DC-T、CIK组比较。

表2 细胞表型检测

*：P<0.05，与DC、DC-T、CIK组比较。

*：P<0.05，与DC组、DC-T组和CIK组比较。

图1 前列腺癌细胞杀伤活性检测

3 讨 论

前列腺癌是老年男性的常见恶性肿瘤之一，前列腺根治性切除术和放疗是治疗早期前列腺癌的有效手段。但对于局部进展期或有远处转移的前列腺癌患者，目前却没有令人满意的治疗方法[1]。为此，本研究探讨以DC-CIK为基础的免疫途径抗前列腺癌的作用。

DC-CIK细胞作为免疫效应细胞在抗肿瘤治疗中因其增殖能力强、杀瘤活性高的广谱抗瘤免疫等优势越来越引起人们的关注。目前，以自体DC-CIK细胞免疫疗法来治疗骨肉瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤已显示出良好的应用前景[4]。研究发现，利用DC-CIK治疗自体造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后复发的9例淋巴瘤患者，有2例患者部分缓解，2例患者病情稳定，其中1例持续了18个月[5]。龚奕等[6]在对50例急性髓细胞白血病进行自体DC-CIK细胞回输治疗中，发现患者总体生存率、无病生存率均高于对照组。尽管如此，DC-CIK细胞毒性增强的免疫效应机制目前尚未完全明了。

DC是目前发现最有效的抗原提呈细胞，可摄取、加工、处理抗原，通过高表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子、共刺激分子、细胞黏附因子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)以及淋巴细胞功能相关抗原(lymphocyte functionassociated antigen1，LFA-1)等细胞表面分子，在体内外能有效激发初始和继发性T细胞免疫应答效应，同时可分泌辅助性T细胞1型细胞因子IL-12，诱导T细胞和自然杀伤细胞(natural killer，NK)产生IFN-γ和增强激活NK细胞的细胞毒活性。CIK细胞是由多种细胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3单克隆抗体等诱导的一种免疫活性细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点，并通过分泌高水平的IL-12、IFN-γ等辅助性T细胞1类细胞因子，以调节体内其他细胞因子的分泌达到促进CIK对肿瘤细胞杀伤作用的敏感性，起到抑制肿瘤和杀伤肿瘤的作用[7]。将具有强大肿瘤抗原提呈能力的DC与具有高效杀瘤活性的CIK细胞共培养，二者可分别通过识别抗原、激活获得性免疫系统和发挥自身的细胞毒活性、分泌细胞因子协同杀伤肿瘤细胞，从而形成高效能的免疫效应。本研究证实DC-CIK组培养上清液中IL-12、IFN-γ浓度水平明显高于CIK组及其他两组。可见，大量分泌细胞因子是DC-CIK细胞抗肿瘤免疫效应的重要机制。

本研究通过体外诱导扩增DC和CIK细胞，将其一起培养，观察共培养物DC-CIK细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用。结果显示DC-CIK细胞能产生强大的抗前列腺癌效应，比同条件下单纯CIK细胞抗肿瘤活性增强，与方慧云等[8]报道的DC-CIK细胞抗鼻咽癌免疫应答效果一致。同时也证实DC-CIK细胞具有比CIK细胞更强的抗肿瘤活性。CIK细胞属于异质细胞群，其抗肿瘤作用与CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞及分泌细胞因子的水平密切相关。同时CIK细胞又是具有NK活性的T细胞，具有T细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点[9]。本研究结果表明，DC-CIK细胞具有高表达CD8+细胞和CD3+/CD56+细胞，即产生了大量的NK细胞样淋巴细胞和细胞毒性淋巴细胞，使抗前列腺癌细胞的免疫效应进一步增强。同时DC的抗原提呈作用能促使CIK细胞分泌IFN-γ的时间延长，分泌量增加，进一步增强对肿瘤细胞的细胞毒活性。本研究结果显示，DC-CIK细胞作为一类强大的抗肿瘤免疫效应细胞，可作为一种抗前列腺癌的免疫治疗方法。

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