布地奈德对哮喘模型大鼠肺组织Toll样受体4和5表达的影响

1浙江省诸暨市人民医院儿科 诸暨 311800 2浙江省台州市中西医结合医院儿科

3浙江省台州中心医院病理科

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目的观察布地奈德对哮喘模型大鼠肺组织Toll样受体4（TLR4）和TLR5表达的影响，探讨TLR在哮喘炎症机制中的作用。方法27只SD大鼠随机分成哮喘组、对照组、布地奈德组，每组9只。制备哮喘大鼠模型，免疫组织化学法检测各组大鼠肺组织TLR4和TLR5表达。结果哮喘组大鼠肺组织TLR4光密度值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；布地奈德组大鼠肺组织TLR4光密度值显著低于对照组和哮喘组（P均＜0.05）。哮喘组大鼠肺组织TLR5光密度值显著高于对照组（P＜0.05）；布地奈德组TLR5与对照组及哮喘组比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。肺组织TLR4和TLR5蛋白表达水平无相关性（r=0.246，P＞0.05）。结论OVA致敏的哮喘模型大鼠肺组织TLR5表达升高，TLR4无变化，TLR5在哮喘中可能起到促炎作用。布地奈德能下调哮喘模型大鼠肺组织TLR4和TLR5表达。

大鼠；哮喘；Toll样受体；糖皮质激素；免疫组织化学

“卫生假说”认为，哮喘患者存在Thl/Th2失衡。“新卫生假说”提出，Treg细胞对Th细胞抑制功能减弱是引起哮喘发作又一重要因素[1]。而Toll样受体（Toll like receptor，TLR）与Thl/Th2失衡和Treg细胞都有密切相关[2-3]，但TLR家族各成员如何参与哮喘炎症过程至今尚未完全清楚。不同亚型TLR所起的作用不尽相同，有些具有促炎作用，有些则反之[4]。本研究观察布地奈德对大鼠哮喘肺组织TLR4和TLR5表达的影响，探讨TLR在哮喘炎症机制中的作用，为临床治疗哮喘提供理论依据。

1 实验材料

1.1动 物 4～5周龄清洁级健康雄性SD大鼠27只，体质量（121±7）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005，饲养于杭州师范大学实验动物中心，清洁级环境，自由进食、水。

1.2药物及试剂 布地奈德（批号LOT309973，1mg/ 2mL，阿斯利康公司生产）；一抗兔抗大鼠TLR3和4单克隆抗体（美国Imgenex公司）；Ⅴ级鸡卵白蛋白（OVA，美国Sigma公司）。

2 实验方法

2.1分 组 27只大鼠随机分成哮喘组、对照组、布地奈德组，每组9只。

2.2模型复制 哮喘组分别在第1天和第8天腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液｛含卵蛋白（OVA）1mg和氢氧化铝［Al（OH）3］100mg｝2mL致敏，各1次。第15天开始每天向大鼠喷雾1%OVA 30min，连续激发7天。对照组致敏和激发阶段均以生理盐水替代OVA和Al（OH）3，布地奈德组致敏和激发方法基本同哮喘组，不同的是在每次激发前30min给予雾化吸入布地奈德溶液1mg/组。

2.3肺组织TLR4、TLR5检测 末次激发24h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏抽血致死。取右肺组织经4%多聚甲醛-PBS溶液固定、石蜡包埋、切片，采用免疫组化SP法测定TLR4和TLR5表达[5]。每张切片随机选择5个细支气管，Image-pro Plus 5.1免疫组化图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度值（OD值）。

2.4统计学方法 数据以均数±标准差（） 表示，应用SPSS16.0统计软件，多组间均数比较采用Oneway ANOVA分析，方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhame's T2检验，两因素的相关分析采用pearson分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠哮喘发作情况 布地奈德组大鼠死亡1只。雾化吸入OVA后，大鼠表现为不停搔痒、喘鸣、气促、烦躁不安、乱窜、腹肌抽搐等症状。哮喘组肺组织见支气管黏膜水肿、黏液腺增生、黏液分泌增多及黏液栓形成，部分黏膜上皮细胞脱落，支气管壁及管腔、肺间质、血管周围见较多的炎性细胞浸润。布地奈德组上述表现较哮喘组明显减轻；对照组肺组织结构完整，仅见少量炎症细胞。

3.2各组大鼠肺组织TLR4表达 阳性细胞胞浆呈棕黄色表达，结构清晰，着色明显高于背景。阳性表达部位为支气管上皮、支气管平滑肌、血管内皮、肺泡上皮为主，血管平滑肌呈阴性表达。哮喘组肺组织TLR4光密度值与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；布地奈德组TLR4水平显著低于对照组和哮喘组（P均＜0.05），见表1、图1（插页）。

表1 各组大鼠肺组织TLR4、TLR5表达水平比较（）

表1 各组大鼠肺组织TLR4、TLR5表达水平比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与哮喘组比较，△P＜0.05

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3.3各组大鼠肺组织TLR5表达 阳性细胞主要为支气管上皮、血管内皮、肺泡上皮为主，支气管平滑和血管平滑肌均呈阴性表达。哮喘组肺组织TLR5光密度值显著高于对照组（P＜0.05）；布地奈德组与对照组及哮喘组差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1、图2（插页）。

3.4相关性分析 肺组织TLR4和TLR5蛋白的表达水平无显著相关性（n=26，r=0.246，P＞0.05）。

4 讨 论

TLR是一种模式识别受体，第一次在果绳身上被发现，属于I型跨膜式识别受体，在细胞内外信号传递中起重要的作用，参与感染、哮喘及肿瘤等疾病的发生和发展。尤其在哮喘炎症机制中可能起着重要的作用[6]，已成为目前研究的热点之一。

小气道炎症是哮喘的主要病理机制，细支气管上皮细胞增生和炎症细胞浸润在哮喘的气道炎症中具有重要的作用。本研究发现，TLR4和TLR5在支气管上皮细胞上呈阳性表达，提示支气管上皮细胞能通过TLR4和TLR5参与哮喘的气道炎症过程。TLR4在支气管平滑肌细胞也阳性表达，TLR5则呈阴性表达，提示TLR4与TLR5不同，TLR4能通过支气管平滑肌细胞起作用。Mansson等[7]也证实支气管平滑肌细胞能表达TLR4，其激动剂能诱导它增加分泌炎症因子IL-6、IL-8等，提示支气管平滑肌细胞能通过TLR4达到致炎的作用。

本研究还发现，肺组织TLR4表达水平在哮喘组与对照组无差别（P＞0.05），可能与TLR4是脂多糖配体而对OVA刺激不敏感有关，与苏苗赏等[8]研究结果相近。而在屋尘螨致敏的小鼠模型中发现，TLR4在支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞上表达增加，认为它具为促炎的作用，屋尘螨可能是它的主要刺激物之一[9]。哮喘组肺组织TLR5表达水平显著高于对照组（P＜0.05），提示TLR5在哮喘的气道炎症中可能起促炎作用。相似的研究发现，TLR5在气道上皮细胞上呈高表达而在肺泡巨噬细胞呈弱表达，且在TLR5基因敲除的小鼠经屋尘致敏后发现，嗜酸细胞的水平显著低于TLR4基因敲除组，证实TLR5具有促进哮喘气道高反应性的作用[10]。在风湿性关节炎患者的关节液中也发现TLR5表达水平升高，且与TNF-α水平显著正相关，证实TLR5是一种促炎的炎症介质[11]。

雾化吸入布地奈德是目前治疗哮喘的首选药物，具有安全和全身性副作用少等特点，已在临床广泛得到应用。我科既往研究也发现，布地奈德具有抑制哮喘炎症的作用[12]，但其机制至今尚未完全阐明。本研究结果显示，布地奈德组TLR4表达水平显著低于对照组（P＜0.05），提示它能下调肺组织TLR4表达。本结果与苏苗赏[8]的研究结果相反，但与韦江红等[13]研究发现地塞米松能下调肺组织TLR4表达改善气道重塑的结果相似。而布地奈德组TLR5表达水平与哮喘组及对照组均无差别，提示布地奈德有下调TLR5的趋势。相关分析发现，TLR4和TLR5在肺组织中的表达水平无内在相关性（P＞0.05）。

综上所述，OVA致敏的哮喘大鼠肺组织TLR5表达升高，TLR4无变化，TLR5在哮喘的炎症中可能起促炎作用。布地奈德能下调TLR4和TLR5的表达，其抗炎作用可能通过下调TLR4和TLR5的途径。本研究存在的不足之处是，实验中样本量偏少，且虽然动物实验较人体容易获得肺组织，但与人类并不完全相同。如要准确、全面评估布地奈德对哮喘患者TLR4和TLR5表达的影响，仍需要对哮喘患者进行大样本、随机对照研究。

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布地奈德对哮喘模型大鼠肺组织Toll样受体4和5表达的影响

方 丽1陈培英1童夏生2范广民3王恩智2

Effect of Budesonide on the Expression of Toll-like Receptor 4 and 5 in Rat Asthma Model

FANG Li1，CHEN Peiying1，TONG Xiasheng2，FAN Guangming3，WANG Enzhi2.1 Department of Pediatrics,People's Hospital of Zhuji,Shaoxing (311800),China;2 Department of Pediatrics,Taizhou Integrated Traditional and Western Medicine Hospital;3 Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Central Hospital.

ObjectiveTo investigate the effect of budesonide on the expression of Toll-like receptor（TLR）4 and 5 in asthma rats and the potential roles of TLR in pathogenesis of asthma inflammation.MethodsTwentyseven SD rats were randomly divided into three groups：asthma group，control group，and budesonide group.The rat model of asthma was established with injection of OVA.The expressions of TLR4 and TLR5 proteins were detected by immunohistochemical method.ResultsNo significant difference in TLR4 expression in lung tissue was noted between asthma group and control group（P＞0.05）.The level of TLR 4 in budesonide group was significantly lower than that in control group and asthma group（Ps＜0.05）.The expression of TLR5 in lung tissue in asthma group was dramatically higher than that in control group（P＜0.05），while it did not differ between budesonide group and control group or asthma group（Ps＞0.05）.No correlation between the levels of TLR4 and TLR5 in lung tissue was found（r=0.246，P＞0.05）.ConclusionIn OVA challenged asthmatic lung tissue，the level of TLR5 was elevated，while the level of TLR4 did not change，indicating that TLR5 may be as a inflammation-promoting mediator in asthma exacerbation.Budesonide can down-regulate the levels of TLR4 and TLR5.

rats；asthma；Toll like receptor；glucocorticoid；immunohistochemistry

浙江省温岭市科技局基金资助项目（No.2009-2-55）

童夏生，E-mail：xshtzg37@163.com

2013-10-13

2014-01-17