HPLC法测定人血浆中烟酸和烟尿酸含量方法探究

陈冬

摘 要：

[目的]建立一个同时测定人血浆中烟酸及其活性代谢物烟尿酸的RP-HPLC方法，并用于临床药代动力学研究。[方法]取1ml人血浆于一干净试管中，加入20μl内标甲硝唑，涡旋10s，再加入3ml乙腈，涡旋1min，3000rpm下离心5min，将上清全部取出置于另一干净试管，加入3ml氯仿，涡旋5min，3000rpm下离心5min，取水溶层（上层）200μl和100μl流动相混匀，取20μl进样，检测波长为262nm。[结果]烟酸，烟尿酸和内标甲硝唑的保留时间为4.5min，7.5min和105min。烟酸和烟尿酸日内与日间精密度的RSD均小于11%，烟酸和烟尿酸在50ng/ml到5000ng/ml范围内线性均良好，烟酸的其他代谢物如烟酰胺、N-甲基烟酰胺等无干扰。

关键词：

烟酸和烟尿酸;色谱法;高效液相;血样处

中图分类号：

TB

文献标识码：A

文章编号：1672-3198（2014）24-0225-03

烟酸为B族维生素之一，对人类和动物的营养有着重要的作用。很多文献都报道了烟酸在脂代谢中的药理作用和烟酸在治疗高脂血症中的广泛应用，但关于烟酸及其代谢产物的药动学研究却鲜有报道，在国内同时测定烟酸和烟尿酸的方法还未见报道。为更好地研究烟酸降血脂作用和副作用的机制，建立一个简便快捷准确测量生物样品中烟酸及其代谢产物浓度的方法是很有意义和非常必要的。

在烟酸测定初级阶段，一系列技术得到了广泛应用，如微生物法、色度法、传统柱色谱法、气液色谱法等，在过去的20年里，高效液相色谱法得到了普遍应用。本法即在前人基础上用高效液相色谱法测定人血浆中烟酸及其活性代谢产物烟尿酸的含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters高效液相色谱系统（Waters 600泵，Waters 2487型紫外检测器，N2000型色谱工作站）;AUW120 D电子分析天平;台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;IKA VORTEX Genious 3涡旋器。

1.2 药品与试剂

烟酸为原料药;烟尿酸标准品纯度为99.9%，批号为20081101;甲醇为色谱纯（天津市四友生物技术有限公司）;水为液相用水;其它试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Plastil ODS C18柱（150mm×4.6mm，5μm）;流动相：甲醇：5mmol/L己烷磺酸钠：冰醋酸（12∶100∶1.2）;流速：1.0ml/min;

检测波长：262nm;灵敏度：0.01AUFS;进样量：20μl;柱温：常温。

2.2 标准溶液的配制

（1）烟酸标准溶液的配制：密称定烟酸标准品1005mg，倒入10ml容量瓶中，用液相水定容，得1mg/ml烟酸标准溶液。（2）烟尿酸标准溶液的配制：精密称定烟尿酸标准品10.02mg，倒入10ml容量瓶中，用液相水定容，得1mg/ml烟尿酸标准溶液。（3）烟酸、烟尿酸混合溶液的配制：1mg/ml的烟酸与烟尿酸标准溶液各取2.5ml，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得250μg/ml混合溶液。

2.3 不同浓度烟酸与烟尿酸混合液的配制

（1）1mg/ml的烟酸与烟尿酸储备液各取1ml，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得100μg/ml混合溶液;（2）1mg/ml的烟酸与烟尿酸储备液各取500μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得50μg/ml混合溶液;（3）1mg/ml的烟酸与烟尿酸储备液各取200μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得20μg/ml混合溶液;（4）100μg/ml的烟酸烟尿酸混合溶液取500μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得5μg/ml混合溶液;（5）100μg/ml的烟酸烟尿酸标准溶液取200μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得2μg/ml混合溶液;（6）100μg/ml的烟酸烟尿酸混合溶液取100μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得1μg/ml混合溶液。

2.4 QC血浆的制备

（1）取空白血浆9ml，加入10μg/ml的混合溶液90μl，剧烈涡旋10min，得血药浓度0.1μg/ml的质控血浆，即QC1血浆;（2）取空白血浆9ml，加入100μg/ml的混合溶液90μl，剧烈涡旋10min，得血药浓度1.0μg/ml的质控血浆，即QC2血浆;（3）取空白血浆9ml，加入250μg/ml的混合溶液90μl，剧烈涡旋10min，得血药浓度2.5μg/ml的质控血浆，即QC3血浆。

2.5 样品处理

（1）取人血浆1ml，加入30μl纯磷酸酸化，再加入500μg/ml的甲硝唑内标溶液20μl，涡旋10s;（2）加入3ml乙腈，涡旋1min，3000rpm下离心5min;（3）将上清液全部取出，置于另一干净试管中，加入3ml氯仿，涡旋5min，3000rpm离心5min;（4）取水溶层200μl，加入100μl流动相，混匀进样20μl即可。

2.6 试验血浆的制备

精密量取人血浆1ml，分别加入烟酸和烟尿酸混合溶液1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml各50μl，使二者的浓度分别为0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml，5.0μg/ml，按“样品处理”方法处理后测定。

2.7 回收率试验

取空白血浆1ml，加入液相水70μl（注：标准溶液50μl和内标溶液20μl），按“样品处理”方法处理，取出水溶层70μl，而后分别加入低、中、高2μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的混合溶液50μl，再加入20μl内标溶液，小心搅匀后进样。一个浓度配制4份，分别进样，每次的峰面积与当天精密度实验中的相应峰面积平均值的比值，即为回收率。

2.8 数据处理

（1）用峰面积标准曲线法计算血样中尿酸浓度;（2）以样品峰面积与内标峰面积的比值对血浆药物浓度进行回归，分别求出烟酸和烟尿酸各自的标准曲线。

3 结果

3.1 色谱行为

在本实验条件下，烟酸、烟尿酸和内标分离良好，保留时间分别为4.5min、7.5min、10.5min。（图1、图2）

3.2 标准曲线

以样品峰面积与内标峰面积的比值对血浆药物浓度进行回归，分别求出烟酸（图3）和烟尿酸（图4）各自的标准曲线。

图3 烟酸标准曲线

图3 烟尿酸标准曲线

3.3 实验方法专属性

取六种不同来源的人空白血浆1ml，按“样品处理”方法处理后进样，观察内源物质的出峰情况，在本实验条件下，烟酸，烟尿酸和内标有较大的色谱峰和较好的分离度，血浆中杂质基本不干扰。

3.4 日内、日间精密度

将低、中、高3个浓度（0.1，1.0，2.5μg/ml）的血浆样品按“样品处理”方法操作，分别在同1天内测定6次和每天测定1次连续3天，计算日内、日间精密度。结果如表1、表2所示，精密度均较好。

表1 烟酸日内、日间精密度

浓度日内日间

（μg/ml）浓度（μg/ml）RSD（%）浓度（μg/ml）RSD（%）

0.10.0947、0.0909

0.1069、0.0945

0.0997、0.0960

5.70.1011

0.0971

0.1173

10.2

1.00.9960、1.0936

1.0110、0.9187

1.0198、0.9897

5.61.0830

1.0048

0.9835

5.1

2.52.4753、2.1655

2.1515、2.2656

2.2948、2.2597

5.12.4745

2.5420

2.3165

4.7

表2 烟尿酸日内、日间精密度

浓度日内日间

（μg/ml）浓度（μg/ml）RSD（%）浓度（μg/ml）RSD（%）

0.10.1120、0.1073

0.1107、0.1017

0.1006、0.0991

5.20.1070

0.1125

0.1051

3.6

1.00.9207、0.9854

1.0662、0.9707

0.9228、0.9188

6.01.1159

0.9641

1.0736

7.5

2.52.2379、2.3250

2.1941、2.3055

2.2990、2.2843

2.22.4007

2.2743

2.3801

2.9

回收率实验结果（如表3、表4）。

表3 烟酸的回收率

浓度回收率（%）均值（%）RSD（%）

（μg/ml）1234

0.1

85.5

87.5

87.3

93.9

88.5

4.18

1.0

104.7

106.3

111.2

110.9

108.3

3.02

2.5

99.9

103.5

103.4

97.8

101.2

2.77

表4 烟尿酸的回收率

浓度回收率（%）均值（%）RSD（%）

（μg/ml）1234

0.1109.1

115.1

119.1

118.1

115.3

3.92

1.0

113.1

116.0

115.8

115.9

115.2

1.21

2.5

99.9

104.3

103.2

101.1

102.1

1.95

4 讨论

4.1 实验干扰

烟酸为B族维生素之一，为正常人体不可或缺的微量物质，正常人体血浆中即有内源性的烟酸，对本实验中烟酸峰的测定有一定干扰，故在实验中应扣除烟酸的内源性本底。但通过专属性实验发现6种不同来源中内源性烟酸的浓度均低于50ng/ml，对实验干扰小，可以忽略不计。

4.2 色谱条件

流动相选择：实验初期，体外测定烟酸和烟尿酸时，用甲醇∶10mmol/L磷酸二氢钠（4∶100，磷酸调pH值）作流动相也有很好的分离效果，但在体内实验中发现由于流动相有机相比例过低，对烟酸峰有很大干扰。故最后采用甲醇∶5mmol/L己烷磺酸钠∶冰醋酸（12∶100∶1.2）作为流动相，结果表明，样品的峰形对称，保留时间适宜。

4.3 血样处理

（1）蛋白沉淀剂。实验中曾用过直接用丙酮沉淀蛋白后进样，发现有高浓度杂质干扰，故不用。之后选择用乙腈沉淀蛋白，效果好，干扰少。（2）调节pH值。回顾整个实验，血样处理时调节pH值是至关重要的一步，详见下文“pH值的影响”分析。

4.4 烟酸和烟尿酸的性质对实验方法选择的影响

（1）水溶性。

烟酸和烟尿酸的水溶性强，有机溶媒无法将药物从血浆中提取出来，故液液萃取不能得到满意效果。本实验现用乙腈沉淀蛋白，将上清全部取出，再用氯仿反提，取水溶层（即上层）进样。用氯仿反提不仅去除了部分干扰，而且有起到了浓缩，提高灵敏度的作用。

（2）酸性。

烟酸和烟尿酸均为弱酸性物质，易与血浆中存在的碱性物质结合，故血浆处理过程中应加一定量酸酸化血浆。同时，二者对酸度非常敏感，响应值、保留时间以及峰形都受酸度的影响。在“pH值的影响”一项中详细讲解。

4.5 pH值的影响

（1）流动相pH值。

实验发现在一定范围内，烟酸和烟尿酸的响应值随着pH值的降低而升高，并且pH值的变化对二者的保留时间和峰形也有影响。考虑到pH值过低对色谱住的损坏，本实验流动相pH值在3.0和3.2之间。

（2）酸对血浆处理的影响。

本实验在血浆预处理中有两步调节酸度的步骤。

第一步：加乙腈前用磷酸酸化血浆，实验初未加磷酸酸化时，烟酸峰被掩盖，烟尿酸峰良好但响应值极低。之后采用100%，75%，50%和25%的磷酸酸化，响应值差别不大，但100%峰形稍好。

第二步：进样前水溶层与定量流动相混匀。实验初不加流动相直接进样，二者均出现肩峰。之后各取水溶层300μl，200μl，100μl与100μl流动相混匀进样观察，发现取200μl与100μl流动相混匀峰形较好。

5 结论

本方法血样处理简便，重现性好，可用于烟酸和烟尿酸在体内的药动学研究。

参考文献

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