绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子病毒感染NIH3T3细胞的研究*

李 坤 丁 宁

近些年来，随着肿瘤的发病机制在基因水平上的逐步阐明，对肿瘤进行基因治疗正成为肿瘤治疗的又一重要策略。目前对肿瘤的基因治疗，是指通过操作遗传物质(无论是人类本身的或外源的)来干预肿瘤的发生、发展和进程，包括纠正人自身基因结构或功能上的错乱，杀灭病变细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗肿瘤的目的。其中深入了解靶基因的功能，寻找要害靶分子，对之实施打击或补充是研究的重要内容。

核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)是一种相对分子质量为50×103的酸性糖蛋白，广泛存在于细胞质可溶性部分。目前研究发现，大多数实体瘤能分泌血管生成素(angiogenin，Ang)刺激血管的形成来供应癌细胞生长和转移[1-3]。而RI能与Ang通过1∶1化学计量比紧密结合并抑制其活性，从而可以抑制实体瘤血管的形成及肿瘤的生长、转移[4-6]。另有研究发现，血管生成素具有促进肿瘤细胞增殖功能，因而RI可能成为肿瘤靶向治疗的有效药物[7]。为进一步研究RI的作用机制，本研究将已构建的过表达人RI基因的pLNCX-EGFP-C1-hRI载体，用上清感染法感染到NIH3T3细胞中，用荧光显微观察法和Western blot法检测egfp-hRI基因在NIH3T3细胞的表达，为下一步基因治疗研究奠定基础[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

反转录病毒pLNCX质粒购自美国CLONTECH公司。pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒是由本室构建，NIH3T3包装细胞购自中国科学院上海细胞库(如图1所示)。

图1 本室构建的pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒

1.2 试剂

质粒中量提取试剂盒购自Omega公司；DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；G418购自美国Merk公司；RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青血清生物制品有限公司；PVDF(聚偏二氟乙烯)膜购自美国Biosciences 公司；Polybrene、ECL化学发光显色试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶抑制因子抗体由本实验室制备；RIPA蛋白裂解液购自南京KEYGEN凯基生物。

1.3 细胞培养

包装细胞PA317、小鼠NIH3T3细胞分别于含10%的胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃、5%的CO2的条件下培养。设置G418梯度质量浓度为0，100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L，500 mg/L，600 mg/L，700 mg/L，800 mg/L，900 mg/L，1000 mg/L，1100 mg/L，1200 mg/L，确定G418筛选浓度：PA317细胞为800 mg/L，NIH3T3细胞为400 mg/L。

1.4 PA317细胞的转染及筛选

细胞按0.5～2.0×105铺板于24孔板中，至细胞汇片至80%时，用Lipofectamine 2000转染试剂按文献[9]进行转染，分为2组：pLNCX-EGFP-C1转染组(对照组)、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组(实验组)。72 h后用800 mg/L G418筛选2～3周，获得抗性单克隆后，繁殖、扩增、鉴定，选择最高抗性克隆留种。其中，对照组阳性细胞命名为PA317/EGFP细胞，实验组阳性细胞命名为PA317/EGFP-hRI细胞，分别收集细胞上清液，采用0.45 μm滤膜过滤，于-80 ℃保存备用。

1.5 NIH3T3细胞感染及荧光观察

取对数生长期细胞按1.0×105铺板于6孔板中，至细胞达到融合度约60%左右时，分别加入1 ml PA317/EGFP和PA317/EGFP-hRI细胞上清、终浓度为2 mg/L的Polybrene。每12 h感染1次，连续感染3次。实验分为2组：PA317/EGFP感染组(对照组)、PA317/EGFP-hRI感染组(实验组)，每组3复孔。感染48 h后，更换含400 mg/L G418的选择培养液，连续筛选2周后，挑取G418的抗性单克隆，繁殖、收获细胞，并用荧光显微镜观察阳性重组质粒在NIH3T3细胞中的表达。同时设正常细胞NIH3T3作为阴性对照。

1.6 Western blot法检测转染后NIH3T3细胞中RI蛋白表达水平

收获细胞，用含1 mMPMSF的RIPA蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法蛋白定量。分别取60 μg蛋白电泳、转膜，5%小牛血清封闭4 ℃过夜，一抗孵育2 h，二抗室温孵育2 h，ECL化学发光试剂盒发光。曝光时间0.5～5 min。由Bio-Rad凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Image LAbTM软件进行定量分析。

2 结果

2.1 荧光显微镜检测阳性重组质粒在NIH3T3细胞中的表达

NIH3T3细胞本身绿色荧光表达微弱(如图2a所示)；PA317/EGFP-hRI感染组(实验组)，在细胞质中可观察到重组质粒pLNCX-EGFP-C1-hRI表达的绿色荧光较强的分布(如图2b所示)；PA317/EGFP感染组(对照组)，在全细胞中都可观察到重组质粒pLNCX-EGFP-C1表达的绿色荧光分布(如图2c所示)。

图2 荧光显微镜检测阳性重组质粒在NIH3T3细胞中的表达(×400)

2.2 Western blot法检测hRI基因在蛋白质水平上的表达

结果表明，空白组(阴性对照)细胞可见RI基因和内参GAPDH基因条带，RI基因相对表达强度分别为0.13±0.037；PA317/EGFP-hRI感染组(实验组)和PA317/EGFP感染组(对照组)皆可见egfi-hRI基因和内参GAPDH基因条带，egfi-hRI基因相对表达强度为0.81±0.28，与空白组和对照组相比，分别增加了83%和81%(如图3所示)。

图3 蛋白质印迹法检测hRI的表达

3 讨论

目前，肿瘤基因治疗已经取得一些长足性进步，基因治疗已经成为肿瘤治疗研究的一种新手段[9-11]。而肿瘤基因治疗载体分为病毒性载体和非病毒性载体。其中逆转录病毒载体是最常见的病毒载体，具有感染效率高、整合稳定等优点，但同时具有产生野生型病毒的危险等缺点[12-13]。本试验采用病毒上清感染方法，虽然转染效率低，但从安全性、可操作性、简便性考虑，似乎更符合临床基因治疗的实际需要。

RI位于胞浆内，定位于染色体11p15.5区，分子质量约为50×103[14-15]。本研究用polybrene介导上清感染法将过表达hRI的表达载体pLNCX-EGFP-C1-hRI(绿色荧光蛋白融合hRI基因载体)转染到NIH3T3细胞中。因为hRI为胞浆蛋白，在荧光显微镜下直接观察到egfp-hRI基因在NIH3T3细胞质中大量表达，而转染空载体pLNCX-EGFP-C1的绿色荧光在NIH3T3全细胞中均匀分布，这与EGFP无定位信号有关。荧光显微镜检测的结果表明，pEGFP-C1-hRI表达质粒的表达成功。Western blot检测egfp-hRI基因在蛋白质水平的表达增加。EGFP相对分子质量约为29×103，hRI蛋白分子质量约为50×103，EGFP融合蛋白分子质量约为79×103。Western blot法检测结果证明egfg-hRI基因被表达，从而表明建立产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的NIH3T3包装细胞系。

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