三氟乙酸/超声波预处理对芒草纤维素结构及酶解效果的影响

李本祥，董新荣，罗 景

（湖南农业大学理学院应用化学系，湖南 长沙 410128）

随着能源问题的日益突出，人们对可再生能源越来越重视，加强对木质纤维素类可再生资源高值利用研究对解决能源危机具有重要的战略意义[1-3]。芒属植物以C4循环方式进行光合作用，生长迅速，生活周期短，抗逆性强，产量高且纤维素和半纤维素占总量的80%以上，是一种理想制备燃料乙醇的木质纤维素原料[4]。但木质纤维素由于其结构复杂，纤维素、半纤维素不但被木质素包裹，而且半纤维素部分共价和木质素结合，纤维素具有高度有序晶体结构，使其纤维素酶解严重受限，因此必须对其进行预处理以去除部分或全部木质素，或在一定程度上改变原料物理化学结构，如降低结晶度，减小聚合度，增加孔隙度和表面积等，以促进酶与底物相互接触并反应，提高酶解速率和总糖得率[5-7]。目前已知预处理方法有物理法、化学法和生物法等，但每种方法单独使用其预处理效果和成本都有待改进[8]。三氟乙酸能够破坏纤维素的晶体结构[9]，超声具有波长较短、能量集中的特点，在各行业有广泛的用途，但利用超声波破坏纤维素晶体结构的报道较少[10]。本研究以三氟乙酸/超声波联合预处理方式处理芒草，考察不同的预处理条件对纤维素晶体结构及酶解效果的影响，为进一步开发以芒草为原料生产生物乙醇技术奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料

芒草秸秆取自湖南农业大学试验田，洗净自然风干后切成1～2cm 的小段，在60℃下干燥36h ,然后用植物粉碎机粉碎，过0.84mm筛, 室温贮存干燥器中备用。

1.2 芒草秸秆的预处理

取粉碎后的芒草秸杆5g置于250mL具塞磨口瓶中，加入三氟乙酸溶液，置于超声波发生器中对试样进行预处理，考察不同的条件对预处理糖化率和芒草酶解糖化率的影响。

1.3 预处理样品的酶解

试样的酶解采用文献[11]方法。取2g纤维素酶(酶活力15000 U·g-1)溶于1000mL的pH为4.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中。称取预处理后的芒草样品3g置于100 mL碘量瓶中，加入33mL纤维素酶溶液（相当于22mg·g-1），摇匀，置于恒温水浴振荡器中，45℃、165r·min-1酶水解 72h，过滤，测滤液中的还原糖，其含量采用DNS 法测定。

2 结果与讨论

2.1 预处理对芒草秸杆组成和结构的影响

2.1.1 XRD分析

XRD曲线可以很好地描述纤维素结晶的状况。图1为预处理前后芒草中纤维素的X衍射图。由图1可以看出，预处理前芒草中纤维素在2θ为22.3°和16.1°各有一个主要峰和次要峰。主要峰代表的是002面峰的强度，即结晶区的衍射强度，次要峰代表的是无定形区的强度。样品经过三氟乙酸溶液处理之后，次要峰变成一组强度很低分布很宽的衍射峰，峰形不再尖锐明显，主要峰强度也明显降低。说明纤维素经过三氟乙酸溶液处理之后，原有晶形受到破坏，结晶度大大降低，这样可为纤维素酶解组分中剪切作用最快、效果最好的内切酶提供更多更好的作用位点，可加快酶解速率，提高还原糖的转化率，这在后面酶解实验中得到验证。同时从图1（A线）中可以看出，纤维素经过三氟乙酸/超声波联合预处理后，次要峰已经完全消失，主要峰的强度进一步降低，说明超声波能够加速纤维素晶形破坏程度，使芒草中纤维素结晶度下降更为明显，经三氟乙酸/超声波联合预处理的底物有更好的酶解效果。

图1 不同预处理方式的纤维素的XRD图Figur e 1 XRD pat ter ns of cel l ul ose sampl es

2.1.2 FTIR分析

由于芒草中纤维素的官能团和化学键在红外光谱中的特定频率都已经知道，因此通过红外光谱可以定性和定量分析纤维素中存在的官能团以及它们在预处理前后的变化[12]。预处理前后芒草中纤维素的红外光谱图见图2。从图2中可以看出，预处理前后纤维素的红外吸收峰形状基本相同，但是吸收强度有所不同，表明预处理使纤维素的形态结构发生了变化。经过酸处理后，表征纤维素中-CH，-CH2伸缩振动的波数为2900cm-1，吸收峰强度降低，表明纤维素大分子中甲基、亚甲基发生了部分断裂，采用三氟乙酸/超声波联合预处理时，波数为2900cm-1的吸收峰强度降低得更明显，说明对纤维素结构破环得更为严重。波数1635 cm-1处的吸收峰是表征吸附水的伸展振动，经预处理后的纤维素中1635 cm-1处吸收峰强度都要明显高于未处理的纤维素中此处吸收峰，说明经过三氟乙酸溶液特别是在超声波的辅助作用下预处理后的物料中纤维素都明显得到润胀，对水的可及度增加。纤维素的润胀对提高芒草的酶解效率起着重要的作用。

图2 不同预处理方式的纤维素的红外光谱图Figure 2 FTIR spect ra of as-r eceived untr eated sampl e

2.1.3 SEM分析

进一步利用SEM技术从宏观角度对预处理前后的芒草纤维素的形貌进行分析，结果如图3所示。未处理的芒草表面结构比较紧密、有序，质地也比较坚硬（图3A），纤维素分子表面十分平滑，结构相当规整，可见分子的平行排布形式（图3a）；经三氟乙酸溶液预处理后纤维素结构变得蓬松、柔软，且具有部分微孔（图3B），纤维素分子表面凹凸不平，有点状突起并夹杂有小孔洞，纤维素表面蜡质及硅晶体受到破坏（图3b）；在超声波辅助作用下纤维素颗粒变得细小（图3C），芒草纤维束发生断裂，纤维素晶体受到破损（图3c）。因此纤维素经过预处理后，特别是经过联合预处理之后，纤维素晶体结构破损，纤维素表面积增加，提高了芒草纤维素与纤维素酶的可及度，从而提高纤维素的酶解效率。

图3 不同预处理方式的纤维素的SEM图Figur e3 Scanning el ect r on micr ogr aphs of sampl e

2.2 预处理方式的选择

图4 为采用不同预处理方式处理2h后在1.3的酶解条件下（下同）对试样进行酶解后的效果。从A和B及C和D比较可以看出，在超声波的辅助作用下预处理试样的酶解效果明显好于未使用的，说明超声波预处理有利于加快芒草的酶水解，主要原因是超声波具有空化作用，能够破坏纤维素的晶体结构，增加试样的酶解可及率，提高其酶解糖化率。

经过以上分析，超声波能提高纤维素酸处理效果，后面的研究拟在采用超声波的辅助作用下，用三氟乙酸预处理芒草，考察不同的预处理条件对纤维素酶水解效果的影响。

图4 不同预处理方式的酶解效果Fig4 Enzymatic hydrolysis efficiency of different pretreated silvergrass

2.3 三氟乙酸浓度对预处理效果的影响

在预处理温度为30℃，时间为4h，固液比为1∶30情况下，以不同的三氟乙酸浓度处理芒草样品，然后进行酶解,其结果如图5所示。从图中可以看出，在酸处理后滤液中，糖含量随着酸浓度的提高而升高，这与文献报道相一致[13]。但对酸处理试样进行酶解时，其酶解糖化率随着酸浓度升高而升高，当酸浓度进一步升高时，其酶解糖化率明显降低。这是因为酸浓度越高，预处理滤液中糖含量升高，消耗纤维素和半纤维素的量增大，预处理后试样中可供酶解的纤维素和半纤维素的含量相对降低，其酶解得率相应也会降低。同时，随着酸浓度的升高，生成酶解抑制物如糠醛的含量也会升高，不利于后续酶解的反应[13-14]。因此，在预处理过程中，以40%的酸浓度比较合适，其处理后试样酶解糖化率达到64.6%以上。

图5 三氟乙酸浓度对预处理效果的影响Fig5 Effect of trifluoroacetic acid concentration on the pretreatment ef f ect iveness

2.4 固液比对预处理效果的影响

在预处理酸浓度为40%，温度为30℃，时间为4h情况下，以不同的固液比处理芒草然后对其进行酶解,其结果如图6所示。从图6可以看出，随着固液比增加，其预处理糖化率和酶解糖化率随着固液比的升高而升高，预处理糖化率随固液比提高而增加不明显，而酶解糖化率随着固液比的升高而提高，当固液比达到1∶30时，其增加不明显，故预处理时选择固液比为1∶30。

图6 固液比对预处理效果的影响Fig6 Effect of ratio of solid-liquid on the pretreatment effectiveness

2.5 预处理时间对预处理效果的影响

在预处理酸浓度为40%，固液比为1∶30，温度为30℃的情况下，采用不同的处理时间处理芒草样品，酶解，其结果如图7所示。从图7可以看出，随着预处理时间的增加，预处理糖化率变化不明显，而预处理试样酶解糖化率在预处理时间达到3h以上时，变化不明显，故选择预处理时间为3h。

图7 预处理时间对预处理效果的影响Fig7 Ef f ect of time on t he pr et r eat ment ef f ect iveness

2.6 预处理温度对预处理效果的影响

在预处理酸浓度为40%，固液比为1∶30，时间为3h，以不同的温度处理芒草样品，酶解，其结果如图8所示。从图8中可以看出，随着预处理温度的升高，预处理糖化率有所增加，但变化不明显，而试样酶解糖化率则明显降低。当预处理温度升高时，半纤维素水解所产生的木糖在高温下会进一步降解为糠醛，糠醛对酶解具有明显的抑制作用[15]；同时，在高温下三氟乙酸与葡萄糖发生酯化反应，所产生的副产物也会对酶解产生一定的抑制作用。根据红外谱图和预处理试样酶解效果分析，在低温下进行预处理对试样酶解效果有利，由于超声波在空化过程中具有加热作用，很难维持低温，故选择预处理温度为30℃。

图8 温度对预处理效果的影响Fig8 Effect of temperature on the pretreatment effectiveness

3 结论

三氟乙酸/超声波预处理芒草能够有效破坏纤维素的晶形结构，增加纤维素酶与底物的酶解可及度，促进了芒草秸杆的酶解糖化率。在40%三氟乙酸溶液、30℃、固液比为1∶30及超声波的辅助作用下预处理4h的芒草秸杆，在pH为4.6、加酶量22mg·g-1、45℃下酶解72h，其酶解糖化率可达64.6%。

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