麦角甾醇的研究进展

曹龙辉，李晓珺，赵文红，2*，朱豪，洪泽淳

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.华南农业大学食品学院，广东广州510642）

麦角甾醇的研究进展

曹龙辉1，李晓珺1，赵文红1，2*，朱豪1，洪泽淳1

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.华南农业大学食品学院，广东广州510642）

麦角甾醇主要存在于酵母菌、霉菌等真菌和某些植物中，是一种重要的植物甾醇，具有重要的生理作用，是食品、饲料及医药等工业中常用的一种原料。文章总结近十年来国内外对麦角甾醇的研究状况，分别对麦角甾醇的生物合成途径、高产麦角甾醇菌株的选育和麦角甾醇的萃取方法予以综述，为进一步研究麦角甾醇提供参考。

麦角甾醇；生物合成；菌株选育；萃取

麦角甾醇，别名麦角固醇，为白色或无色光亮的小叶晶或白色结晶粉末。麦角甾醇不但具有独特的生理作用，还被广泛应用到药物的开发中。麦角甾醇作为真菌细胞膜的重要组成成分，结构稳定，专一性强，对测定生物量来说，它比葡糖胺更具代表性[1]，所以可以通过检测麦角甾醇的含量来测量真菌的生物量[2]。目前，麦角甾醇的来源主要通过微生物发酵合成得到，近年来也有学者从一些菌丝体中提取。我国研究麦角甾醇机能的时间较迟，生产工艺相对落后，年产量不能满足消费者的需求，需要从国外进口，但从总体来看，我国对麦角甾醇的需求量呈逐年上升的趋势。因此，对麦角甾醇的开发和利用具有重要的经济价值。

1 麦角甾醇性质及应用

麦角甾醇化学名为24β-甲基胆固醇-5，7烯-3β-羟基，分子式为C28H44O，强氧化剂能破坏麦角甾醇，遇到光和空气中的氧时，即使在常温下也会被氧化而发黑。麦角甾醇不溶于水，但易溶于有机溶剂（三氯甲烷、乙醇、乙醚等）。

麦角甾醇是微生物细胞膜的重要组成部份，对确保细胞活力、膜的流动性、膜结合酶的活性、膜的完整性以及细胞物质运输等起着重要作用[3]。具有良好的流动性的酵母细胞膜，具有较高的耐冻能力[4]。宋振玉等[5]研究指出，低糖适应性耐冻酵母菌的麦角甾醇含量明显高于普通酵母。目前的大多数常用的抗真菌药物都是针对麦角甾醇生物合成中必需的关键酶设计的抑制剂，其通过竞争性地与关键酶结合，抑制麦角甾醇合成，使真菌的细胞膜受到破坏，从而抑制真菌的生长繁殖。

麦角甾醇可以增强人体抵抗疾病的能力，是重要的脂溶性维生素D2源，具有明显的抑菌、抗肿瘤[6]功效。而转化物维生素D2可以作为饲料添加剂添加在饲料中，增加畜禽的产蛋率和孵化率[3]。麦角甾醇也可以作为重要的医药化工原科，用于生产“可的松”、“激素黄体酮”等甾醇类药物。

2 麦角甾醇的生物合成途径

麦角甾醇的合成途径主要分为4个关键步骤，首先是甲羟戊酸的生物合成。甲羟戊酸是胆甾醇、萜烯（terpene）类等类戊二烯生物合成的重要中间体，由乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMGCoA）后，经还原并脱去辅酶A而产生；其次是甲羟戊酸转化为角鲨烯，接着角鲨烯环化形成羊毛甾醇；最后羊毛甾醇转化为麦角甾醇，这是相比前三个步骤较为复杂的一个过程，其中参与的基因和酶有很多种[7]。途径中的每个基因与生物体的生存密不可分，这些基因分为2种：必需基因和非必需基因，在合成途径前期的一些基因如ERG9、ERG1、ERG7、ERG11、ERG24、ERG25、ERG 26、ERG 27被当作是必需基因，而其他基因则被当作是非必需基因[7]。ERG9基因编码角鲨烯合成酶[7-8]，催化2分子焦磷酸法呢酯形成麦角甾醇生物合成途径中第一个甾醇分子，是麦角甾醇合成的直接前提[8]；ERG1基因和ERG7基因分别编码角鲨烯环氧酶和羊毛甾醇合成酶[7-8]，这两种酶在麦角甾醇的合成途径中是两个重要、独特而且必需的酶；ERG6基因高表达的重组酵母菌，不但可以补偿ERG2基因高表达对甾醇合成的负效应，而且进一步提高了麦角甾醇含量[9]。ERG2基因和ERG24基因是酵母甾醇生物合成基因，分别编码C-8固醇异构酶和C-14还原酶[7-8，10]，是吗啉抗真菌化合物的目标，酵母ERG24基因编码的C-14还原酶是有氧酵母生存必不可少的[10]，而进一步的遗传分析表明，ERG24基因结合突变ERG6基因或ERG28基因可以致死[11]。

生物体内合成麦角甾醇是多种酶参与的复杂的代谢过程，至少涉及到15种酶的参与[7]、23步反应以及25个结构基因，由于各反应在整个代谢途径中的位置不同，在代谢调控中的作用不同，因此相关基因高效表达的效果也不尽相同。有些基因与麦角甾醇的合成起协同作用，而有些基因的高度表达则抑制麦角甾醇的合成。

3 高产菌株选育的方法

国内外麦角甾醇的生产主要采用微生物发酵法，目前大量生产麦角甾醇主要的菌株是酵母菌，也有利用曲霉等生产。菌株的种类影响最后麦角甾醇产量的多少，高产菌株的筛选方法有很多，最常见的有自然选育、诱变选育、原生质体融合和基因工程4种。

3.1 自然选育

自然选育是从现有菌株中筛选高产菌株，是选育优良菌株的基本方法[12]。杨婉身等[13]介绍一种快速、简便、可靠的筛选麦角固醇高产酵母菌株的方法，就是将自溶后的酵母菌用超声波破碎，用乙醚萃取其所含麦角甾醇，利用乙酸酐在酸性条件下与麦角甾醇生成绿色化合物的原理，可直接根据绿色深浅来判断菌株的优劣。朱效刚等[14]对16株产麦角甾醇的红曲菌进行筛选，得到一株产麦角甾醇较高的红曲菌SJS-20，并对其产麦角甾醇的条件进行了优化，每克干曲中可含8.1mg的麦角甾醇。宋文霞等[15]筛选到一株产麦角甾醇的红酵母，这株菌株可以获得0.338 3g/100mL的麦角甾醇，每克干菌丝体中麦角甾醇的含量最多可达3.612g。

3.2 诱变选育

诱变选育是利用能提高诱发基因突变频率的诱变剂对菌株进行处理，诱变剂的种类一般可分为3类：物理诱变、化学诱变和生物诱变。这种方法可以直接获得高产麦角甾醇的菌株，并且诱变产生的菌株效果比较理想，但诱变选育的随机性太大，整个过程耗费时间长，且诱变选育的工作量非常大，结果具有不确定性。张沧桑等[16]通过氦氖（He-Ne）激光和紫外线对酿酒酵母S-12进行诱变，得到了可产麦角甾醇含量达2.39%的突变株S-97-71。谢宗良[17]从63株酵母菌中筛选出高产麦角甾醇的菌株“石-3”，并对其进行化学和物理诱变，从120株诱变菌株中得到麦角甾醇高产菌株“石-3-57”，其菌体中的麦角甾醇含量高达0.34g/L，比“石-3”菌株中的含量提高了11.5%。

3.3 原生质体融合

原生质体融合方法突破了传统方法的一些局限性，其是将拥有高生物量和麦角甾醇含量等优良性状的菌株的单倍体进行原生质体融合，从而获得优于亲株的融合子。刘波等[18]以麦角甾醇含量较高的酿酒酵母和细胞生物量较高产阮假丝酵母为亲本菌，通过原生质体电融合，筛选得到融合子PF-4菌株，经测定其麦角甾醇含量达到2.01%，比亲本菌株的含量要高。熊宁波[19]从10个不同种属的酵母菌中，筛选得到生物量较高的酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和麦角甾醇含量较高的酵母菌（Saccharomyces kluyveri），经甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）诱变这两种菌株分离得到的单倍体后得到TK15-94-33、TK63-41-72菌株，然后以这两种菌株为亲本进行原生质体融合得到一株具有两亲株优良特性的菌株TKF37，经过检测，TKF37的麦角甾醇含量为2.12%，生物量为3.7lg/100mL。

3.4 基因工程

基因工程可以对菌株体内特性的基因及其特定编码表达的酶进行改造，控制麦角甾醇在整个代谢过程的表达方向，获得高产麦角甾醇的基因工程菌株。宫莉等[20]对麦角甾醇酵母基因工程菌株的发酵培养条件进行研究，并在实验中得到了高达3.05%的麦角甾醇含量。孟云霞等[21]研究了ERG6基因片段的表达对酵母菌合成麦角甾醇的影响，酿酒酵母单倍体菌株YS58用载体质粒YEp352和表达质粒pPERG6转化，得到重组菌株YS58（pPERG6），而重组菌株YS58（pPERG6）的生物量和麦角甾醇含量分别是对照菌YS58（YEp352）的1.23和1.32倍，进一步证明了甾醇C-24甲基转移酶活性的高度表达增强了细胞合成麦角甾醇的能力。利用现代生物技术提高酵母细胞合成麦角甾醇含量、降低生产成本是以后研究的新思路，由于这种技术花费的成本较高，技术难度大，所以还没有得到广泛应用，随着麦角甾醇的生物合成途径被揭示，基因工程将会成为选育麦角甾醇高产菌株的一种非常重要、新颖的手段。

4 高产麦角甾醇菌株的筛选

酵母菌是生产麦角甾醇最主要的菌种，菌种的优劣直接关系到麦角甾醇产量的多少。经研究证明，培养基、培养时间、初始pH和温度以及无机盐[22]等对酵母菌株生产麦角甾醇起着至关重要的作用。除了发酵条件和麦角甾醇合成酶系的研究之外，筛选高产麦角甾醇的菌株同样是亟待解决的问题，由于各个生物体合成麦角甾醇的能力存在显著的差异，因此，必须通过不同的方法来诱导、筛选出高产麦角甾醇的菌株。工业中采用微生物发酵法生产麦角甾醇，但得率一般在2%以下，使得企业的生产成本花费较高，造成资源浪费。而经过筛选出来的菌株，麦角甾醇的含量明显有所提升。惠丰立等[23-24]从12株产麦角甾醇的酵母菌中，筛选出的一株产量较高的酵母菌YN2，经优化培养条件后得到2.2%麦角甾醇，生物量稍微有所提升；张博润[25]筛选出一株高产麦角甾醇酵母工程菌，大大提高了生产得率，降低了生产成本；张毅[26]则筛选出一株酿酒酵母scut-B6305，该酵母麦角甾醇高产菌株的单位细胞麦角固醇含量达到5.63mg/g，比出发菌株提高了30.32%。

5 麦角甾醇的萃取方法

5.1 皂化回流法

在皂化萃取麦角甾醇的过程中，影响麦角甾醇产率的因素很多，皂化剂、皂化温度、纯碱比都是影响麦角甾醇收率的重要因素，皂化萃取时，可以加入一些低级醇，提高皂化反应的反应速率[27]。因为菌株生理特性的差别，各文献中的皂化具体条件差别较大，为了得到最佳皂化条件，姚广印等[28]对酵母产麦角甾醇的具体提取方法进行研究，并在各类菌株上进行验证，最后对比其他方法，提出了对麦角甾醇进行皂化提取的最佳方法。韩庆雪等[27]以皂化温度、碱浓度、醇碱比和物料皂化剂比等因素作为研究对象，分析得出乙醇在皂化液中的比例是影响麦角甾醇萃取效率的主要因素。而薛冬桦等[29]研究认为，乙醚相比乙醇、氯仿、正庚烷3种有机溶剂是比较好的萃取剂。作为最传统的萃取方法，皂化回流法成本低、耗能少、操作方便，但这种方法萃取麦角甾醇的缺点是有机溶剂的使用量大，生产成本高，而且生产管理要求严格，安全系数小。因此，研究一种简便快速、无毒安全的绿色萃取技术，对酵母中麦角甾醇的测定十分必要。李敏等[30]在乙醇碱皂化体系中加盐形成双水相体系，用双水相萃取代替传的乙醚、石油醚或正庚烷的溶剂萃取，不需再加任何溶剂，不仅价廉、无毒，而且更简便、快速，具有一定的实际应用价值。相比其他方法，皂化回流法仍然有着不可比拟的优势，因此也是萃取麦角甾醇最常用的方法之一。

5.2 超声波、微波萃取法

超声波萃取法省时、节能、高效，并且可以避免高温对提取物的影响。影响超声波萃取麦角甾醇的关键有4个因素，分别是浸提液、浸提反应温度、超声波振动时间以及浸提比。蒋岚等[31]利用超声波处理从古尼拟青霉菌丝体中获得7.84mg/g的麦角甾醇；谢翎等[32]利用三氯甲烷作为浸提剂，超声波处理30min，每克干菌丝可获得7mg左右的麦角甾醇。微波萃取的速度比常规方法快约6倍，并且可以克服其他方法样品和试剂使用量大等缺点，MONTGOMERY H J等[33]使用微波萃取土壤中的麦角甾醇，首次使用这种方法来分析土壤中真菌的生物量。

5.3 超临界流体CO2萃取法

超临界流体CO2萃取法因具有安全、洁净、稳定、提取的产品质量高和产品成分不易受到干扰而被广泛应用在食品、医药等工业中，是近年来出现的一种基于水溶性高聚物的新型萃取体系[34]。宋师花等[35]通过对超临界CO2萃取法提取灵芝中麦角甾醇进行研究，结果表明，超临界流体CO2萃取法可以跟传统的方法取得同等的效果，证实了超临界流体CO2萃取法在实际应用中的作用，为麦角甾醇的提取提供了一种全新、可靠、可行的方法。

超临界CO2萃取分离技术是一种很有前途的绿色环保技术，能提供更高的选择性，缩短萃取时间，并且不使用有毒的有机溶剂，超临界流体萃取法有可能取代传统使用有机溶剂萃取的方法[36]。实际使用中常与高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用等检测方法结合，能提高对天然产物活性成分含量测定的效率与精确度，对于促进超临界CO2萃取技术的应用发展具有十分重要的意义。

6 展望

麦角甾醇作为一种安全、营养、滋补的天然产物，在现今食品问题频繁出现的情况下越显得符合人们生活水平提高后渴望无公害的产品的期望。麦角甾醇在医药、化工、食品中应用广泛，是一种潜在的具有丰富的经济价值和研究价值的代谢物，研究麦角甾醇具有重大的意义。在今后的研究，对麦角甾醇可以从以下3个方面进一步研究：（1）筛选高产麦角甾醇的菌株，利用微生物生长周期短，繁殖能力强，安全易提取等特点大量生产麦角甾醇；（2）运用生物技术等现代科技弄清麦角甾醇的合成机制，为麦角甾醇的生产提供进一步的理论基础；（3）开发新的提取和检测方法，提高麦角甾醇的产量。

[1]韩北忠，王家槐.固态发酵中生物量的评估和测定[J].中国酿造，2001，20（3）：6-7.

[2]VERMA B,ROBARTS R D,HEADLEY J V,et al.Extraction efficien-cies and determination of ergosterol in a variety of environmental matrices[J].Commun Soil Sci Plan,2002,33(15-18):3261-3275.

[3]韩庆雪.麦角固醇提取工艺的中试放大研究[D].天津：天津大学硕士论文，2007.

[4]MURAKAMI Y,YOKOIGAWA K,KAWAI H.Lipid composition of a freeze-tolerant yeast,Torulaspora delbureckii,and its freeze-sensitive mutant[J].Appl Microbiol Biot,1995,44(1-2):167-171．

[5]宋振玉，李楠，张姝低.糖适应性耐冻酵母菌与普通酵母菌细胞构成成分的比较[J].中国酿造，2009，28（6）：57-57.

[6]高虹，史德芳，杨德，等.巴西菇麦角甾醇抗肿瘤活性及作用机理初探[J].中国食用菌，2011，30（6）：35-39.

[7]林晓珊，江宏文，张毅.酵母麦角固醇生物合成及其基因调控的研究[J].生物学杂志，2010，27（6）：83-86.

[8]南春辉.麦角甾醇的研究进展[J].中国新技术新产品，2009（10）：6-7.

[9]ZHANG Z,HE X,LI W,et al.Regulation role of sterol C-24 methyltransferase and sterol C-8 isomerase in the ergosterol biosynthesis of Saccharomyces cerevisiae[J].Acta Microbiologica Sinica,2009,49(8): 1063-1068.

[10]CROWLEY J H,SMITH S J,LEAK F W,et al.Aerobic isolation of an ERG24 null mutant ofSaccharomyces cerevisiae[J].J Bacteriol,1996, 178(10):2991-2993.

[11]BHUIYAN M S A,ECKSTEIN J,BARBUCH R,et al.Synthetically lethal interactions involving loss of the yeast ERG24:The sterol C-14 reductase gene[J].Lipids,2007,42(1):69-76.

[12]江宏文，张毅，林晓珊.麦角固醇高产菌株选育方法的新进展[C].科技创新与食品产业可持续发展学术研讨会暨2008年广东省食品学会年会论文，2008.

[13]杨婉身，梁如玉.麦角固醇高产酵母菌的快速筛选方法[J].四川农业大学学报，1997，15（3）：11-13.

[14]朱效刚，许赣荣，李颖茵，等.红曲霉固态发酵产麦角甾醇工艺条件的优化[J].食品研究与开发杂志，2005，26（2）：72-75.

[15]宋文霞，韩小龙，关凤梅，等.红酵母发酵生产麦角固醇的研究[J].食品研究与开发杂志，2006，27（6）：7-9.

[16]张沧桑，李惠珍，许旭萍.麦角固醇突变株啤酒酵母S-97-71的诱变选育及其优化发酵条件的研究[J].药物生物技术，2001，8（5）：251-354.

[17]谢宗良.产麦角固醇酵母菌的筛选、诱变与发酵条件优化[D].保定：河北大学硕士论文，2007.

[18]刘波，薛冬桦，王红蕾，等.电融合原生质体构建麦角甾醇酵母菌株的研究[J].食品科技，2007（3）：21-21.

[19]熊宁波.麦角甾醇产生菌的选育及其发酵条件研究[D].天津：天津科技大学硕士论文，2003.

[20]宫莉，吴洪发，宋公明，等.麦角甾醇酵母基因工程菌株的发酵培养条件[J].吉林大学学报（医学版），2010，36（4）：807-810.

[21]孟云霞，何秀萍，刘楠，等.甾醇C-24甲基转移酶基因在酿酒酵母中的内源表达及工程菌麦角甾醇的合成[J].生物工程学报，2008，24（1）：40-45.

[22]ZHANG B,HE X,TIE C,et al.Construction of high ergosterol-producing yeast strains and study on the optimal conditions for culture[J].Chin J Biotechnol,1999,15(1):43-49.

[23]惠丰立，褚学英，魏明卉.无机盐对酵母菌产麦角固醇的影响.南阳师范学院学报，2003，2（6）：61-62.

[24]惠丰立，魏明卉，褚学英.产麦角固醇酵母菌株的筛选及发酵条件的优化[J].中国医药工业杂志，2004，35（3）：138-140.

[25]张博润.一株产麦角甾醇酵母工程菌及其选育方法与应用：中国，CN200410032719.X[P].2004-04-16.

[26]张毅.一种酵母麦角固醇高产菌株及其选育方法与应用：中国，CN201210364703.3[P].2012-09-27.

[27]韩庆雪，闻建平，冯国龙.麦角固醇工业化提取工艺研究[J].河北化工，2007，30（2）：42-43.

[28]姚广印，张双凤，谢宗良.酵母细胞麦角固醇的提取条件[J].河北大学学报：自然科学版，2007（2）：195-199.

[29]薛冬桦，李亚丽，李秀萍，等.酿酒酵母中提取麦角甾醇的研究[J].食品科学，2007（5）：93-96.

[30]李敏，董慧茹.双水相萃取-高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量[J].分析试验室，2009，28（11）：119-122.

[31]蒋岚，于士军，张莹，等.古尼拟青霉麦角甾醇高产液体培养条件及提取工艺的优化[J].菌物学报，2012，31（3）：413-421.

[32]谢翎，陈红梅，陈安徽，等.超声波破碎法提取球孢白僵菌麦角甾醇的条件优化研究[J].徐州工程学院学报，2007，22（2）：10-13.

[33]MONTGOMERY H J,MONREALB C M,YOUNGC J C,et al.Determinination of soil fungal biomass from soil ergosterol analyses[J].Soil Biol Biochem,2000,32(8-9):1207-1217.

[34]唐仕荣.超临界CO2萃取技术及其在天然产物提取中的应用[J].化工时刊，2007，21（7）：71-74.

[35]宋师花，贾晓斌，陈彦，等.超临界CO2萃取灵芝子实体中麦角甾醇的实验研究[J].中国中药杂志，2009，34（14）：1873-1785.

[36]SANTANA A,JESUS S,LARRAYOZ M A,et al.Supercritical carbon dioxide extraction of algal lipids for the biodiesel production[J].Procedia Eng,2012,(42):1755-1761.

Research progress on ergosterol

CAO Longhui1,LI Xiaojun1,ZHAO Wenhong1,2*,ZHU Hao1,HONG Zechun1
(1.College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225; 2.College of Food Science,South China Agriculture University,Guangzhou 510642)

Ergosterol is an important plant sterol and plays an important physiological role in yeast,mold,other fungi and certain plants.It is commonly used as a raw material in food,feed and pharmaceutical industries.The ergosterol research status home and abroad in the last decade was summarized;meanwhile,the ergosterol biosynthetic pathway,the extraction method and ergosterol breeding high-yielding strains of ergosterol were reviewed to provide a reference for the further study.

ergosterol;biosynthesis;strains breeding;extraction

TS201.3

A

0254-5071（2014）04-0009-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.003

2014-02-28

国家星火计划项目（2011GA780013）

曹龙辉（1990-），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。

*通讯作者：赵文红（1966-），女，教授，硕士，研究方向为食品研究与开发。