秦巴山区柿叶中挥发性成分及抗氧化性研究

豆佳媛，王奇，冯巩

（陕西理工学院 化学与环境科学学院，陕西汉中723000）

柿叶为双子叶柿树科（Ebenanceae） 柿树属（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的叶。柿树为常绿或落叶乔木或灌木，主要生长在热带和温带，约有6 属450种，其中我国有柿树2 属50 多种，栽培面积约2.0×105hm2，产量占世界总产量的50%以上，是世界上最主要的柿树生产国。柿树在我国已2000 多年的栽培历史，也是我国重要的经济树种之一。柿叶中含有丰富的维生素C、黄酮、芦丁、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体有益的营养成分，具有较高的营养价值和医疗保健作用。目前，我国柿叶开发的产品种类较少，品质低。最成功的是在柿叶茶制备技术的研究上。关于柿叶化学成分的研究报道较少，其挥发性成分及生物活性的研究国内外更少有报道，而且主要集中在挥发油提取工艺和化学成分分析研究上[1-5]。近年来的研究表明柿叶具有明显的抗氧化作用。石锦芹等[6-7]的研究表明，柿叶无水甲醇提取物对猪油的抗氧化作用较强，优于柿叶无水乙醇提取物、体积分数70%甲醇提取物和体积分数70%乙醇提取物；而柿叶水提取物的抗氧化作用不明显。用不同溶剂提取的柿叶提取物的抗氧化性能不同。马希汉等[8]研究认为，柿叶的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物均有很强的抗氧化作用，而以石油醚提取物抗氧化作用最强。对上述各类提取物中有效成分的系统分析还未见到报道。为了开发利用柿叶，本文仅报道作者对其脂溶性挥发性成分用GC/MS/DS 联用技术分离鉴定及相对含量的测定结果，并进行了抗氧化活性的研究。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

GC6890N/MSD5973N 色质联用仪：美国安捷伦公司；PDP11/24 计算机及11/250 数据处理系统；UV-6系列紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；101 型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司。

经过处理的无水乙醚、石油醚、氯化钠、无水硫酸钠、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢、磷酸二氢钠、磷酸氢钠等试剂均为分析纯。

1.2 样品及挥发性成分的提取

被分析的柿叶取自秦巴山区（5月初的鲜叶）用自来水将鲜柿叶洗净、风干、粉碎，取300 g 放入索氏提取器用石油醚提取，减压浓缩后，在100 mL 烧瓶内，加水至瓶1/2 高处使试样完全浸透后进行蒸馏，蒸至馏出物无味为止。蒸出物中加入25 g/L 的氯化钠水溶液以提高萃取率[9]，萃取3 次，用无水硫酸钠除去萃取液中的水，挥发乙醚后得到黄绿色挥发油，有较浓的清香味，待用。

1.3 GC/MS 分析

测试条件：GC 汽化室温度250 ℃，HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，50 ℃恒温2 min，然后以4 ℃/min 的升温速率由80 ℃程序升温至290 ℃，恒温30 min，载气为99.999%高纯氦。

MSD 离子源为EI 源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV；使用美国NIST05 谱库。

2 结果与讨论

2.1 脂溶性挥发性成分

柿叶的挥发油，经气相色谱质谱分离出26 个组分，见表1。

经气相色谱质谱联用技术对挥发性物质进行分离和鉴定，运用气相色谱面积归一化法确定各组分的相对含量，分离出26种组分，鉴定出26 中化合物，其中有21种含氧化合物，其在挥发性成分中的质量分数为84.237%。以4-甲基-2.6-二特丁基苯酚（39.967%）、植烯醇（6.831%）、2-甲氧基-3-丙烯基-苯酚（4.578%）为主。这26 个组分中，酚类物质有5种，酮类物质有4种，酸类物质有4种，醛类物质有2种，酯类物质有1种，醇类物质有1种，其中酚类物质相对含量为44.915%，是柿叶挥发油的主要成分，说明柿叶挥发油具有较强的抗氧化作用。

表1 柿叶中挥发油组分分析Table1 The components analysis of volatile oils in Persimmon leaves

2.2 体外·OH 自由基清除作用考察

用邻二氮菲-Fe2+氧化法[9]测定Fe2+/ H2O2体系中·OH 自由基清除率。准确称取柿叶挥发油0.087 g，用蒸馏水配制成0.18g/L 的柿叶挥发油溶液，取6 只已编号的25 mL 容量瓶，分别加入0.75 mmol/L 邻二氮菲溶液1.0 mL，pH 7.4 的0.2 mol/L PBS（磷酸盐缓冲液）1.5 mL，混合均匀，分别加入0.75 mmol/L 新配置的硫酸亚铁溶液1.0 mL，向1～6 号量瓶中分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 柿叶挥发油溶液，摇匀，再向每只量瓶中加入新配制的0.01 % H2O2溶液1 mL，另取2只25 mL 量瓶并分别标记为损伤管和未损伤管，这2 只量瓶中均不加柿叶挥发油溶液，且在损伤管中加入0.01%H2O2溶液1 mL，未损伤管不加H2O2，用蒸馏水将8 只容量瓶定容到至刻度，充分摇匀，于37 ℃恒温水浴中培养60 min，取出，冷却至室温，于512 nm 测定吸光度（n=3）。按下式计算·OH 自由基清除率（I）。

式中：A2为柿叶挥发油溶液的吸光度；A1为未损伤溶液的吸光度；A0为损伤溶液的吸光度。绘制柿叶挥发油质量浓度-清除率曲线见图1。

图1 柿叶挥发油对体外·OH 自由基清除作用曲线Fig.1 Volatile oils in persimmon leaves of·OH radical scavenging effect in vitro

由图1可知，柿叶挥发性物质对H2O2/Fe2+体系通过Fenton 反应产生的·OH 自由基有明显的清除作用，且随着挥发油浓度的增加呈明显的上升趋势，当浓度为0.008 6 g/L 时，体外·OH 自由基清除率达44.95%，充分说明了柿叶挥发性物质具有较强的抗氧化活性。

3 结论

用GC/MS/DS 联用技术测定对秦巴山区五月份柿叶用石油醚提取、水蒸气蒸馏提取其中脂溶性挥发性化学成分进行分离和鉴定，运用气相色谱面积归一化法确定各组分的相对含量。分离出26种组分，鉴定出26 中化合物，其中有21种含氧化合物，其在挥发性成分中的质量分数为84.237%。以4-甲基-2.6-二特丁基苯酚（39.967%）、植烯醇（6.831%）、2-甲氧基-3-丙烯基-苯酚（4.578%）为主。同时对其抗氧化活性进行考察。柿叶中挥发油对Fe2+/H2O2体系·OH 基自由基的清除作用，随着加入量的增加，清除率呈明显的上升趋势，当达到一定浓度时，其对·OH 自由基的清除率基本保持不变。清除率和柿叶中挥发性物质用量存在一定的量效关系，均可以说明柿叶中挥发油具有很强的抗氧化性。该研究尚属首例，为进一步柿叶的利用提供理论支撑，柿叶的其他生物活性实验和开发利用还有待研究。

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