Nrf2-ARE信号通路与肌萎缩侧索硬化的研究进展

王富敏 于继徐 车峰远

(临沂市人民医院，山东 临沂 276000)

目前全世界肌萎缩侧索硬化(ALS)发病率约为(4～6)/100 000，临床主要表现为缓慢起病、进行性发展的肌肉无力、肌萎缩、肌束震颤、腱反射亢进和病理征阳性。患者一般多于发病3～5年后因呼吸肌麻痹、呼吸衰竭而死亡，只有10%的患者生存期超过10年〔1〕，目前暂无特效治疗办法〔2，3〕。根据其发病形式，可分为散发性ALS(sALS)和家族性ALS(fALS)，其中fALS约占全部病例的10%。约10%～20% fALS患者与编码Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)1基因的错义突变或小片段缺失相关〔4，5〕。可导致fALS的突变基因包括SOD1、反式激活应答(TAR)结合蛋白及肉瘤融合脂肪肉瘤转录蛋白(FUS/TLS)的基因编码突变〔6〕。另外，C71G、M114T、E117G和G118V四种突变也已在fALS中被发现〔7〕。ALS发病机制可能主要集中在Cu/Zn SOD突变、氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体功能不良、细胞骨架异常、蛋白聚集及遗传因素等〔8，9〕。氧化应激是导致慢性运动神经元变性死亡的主要因素〔10〕。而在 ALS 治疗中应用的一些外源性抗氧化剂(如 N-乙酰半胱氨酸、维生素 E、褪黑素等)其治疗效果并不令人满意〔11～13〕。目前研究认为，机体在产生氧化应激的同时，体内内源性抗氧化系统也会被激活，从而抑制氧化应激所造成的损伤，使机体处于防御平衡状态。核转录因子(NF)-E2相关因子2-抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)通路是体内内源性抗氧化系统中至关重要的一条通路。Nrf2是细胞抗氧化应激的中枢调节者〔14〕，在细胞介导的抗氧化防御反应中具有重要的作用。近几年，Nrf2-ARE通路在神经系统疾病中的作用已日益得到重视。现就Nrf2-ARE通路与ALS发病机制的关系及在ALS治疗中的前景进行综述。

1 Nrf2-ARE通路的基本结构

1.1Nrf2基本结构 Nrf2 是一种66 000的蛋白质，其有一个基本的亮氨酸结构域，属于CNC-bZIP，即CNC 亮氨酸拉链转录激活因子家族，该家族有6个成员，包括NF-F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、BTB-CNC异体同源体(Bach)1和Bach2。Nrf2 是其家族成员中活力最强的转录调节因子，几乎在各种细胞中均可表达。在Nrf2基因中含有多个同源结构域，分别命名为(Neh)1～6。Neh1有一个CNC型的亮氨酸拉链结构，是Nrf2与DNA及与其他NF结合形成二聚体的必要条件〔15〕。Nrf2与DNA 的NF-E2 区的ARE序列(GTGACTCAGCA)结合，两者结合之后可以启动下游目标基因转录和表达〔16〕。因此，在细胞防御过程中，Nrf2可以通过ARE 来调节机体内多种细胞防御蛋白(比如：NQO1、GST、HO-1、Ferritin等)，以维持机体内环境的稳态。

1.2ARE基本结构 ARE主要存在于Ⅱ相代谢酶基因启动子5′端调控区，在NF及信号通路方面有着重要的增强作用。研究表明，ARE的核心序列为5′-TGACnnnGC-3′是诱导Ⅱ相代谢酶和亲电子物质转录活化所必需的，其5′端基因在激活后可诱导产生大量的保护性基因〔17〕。其激活后能够调节包括抗氧化防御因子和抗炎症因子在内的多种蛋白酶的基因表达。

2 Nrf2-ARE信号通路的调节

在生理状态下，细胞质中绝大部分的Nrf2与其抑制性蛋白胞质接头蛋白(Keap)1相结合，处于非活性状态，Nrf2中的Neh2 结构域是其结合部位；而胞核中则有一少部分的Nrf2以活性状态形式存在，以介导下游基因的基本转录。当机体暴露于氧化应激或亲电子物质时，胞质中的Nrf2 就会从Keap1-Nrf2 的复合物中解离，从而被激活。研究发现，Nrf2激活的方式主要有3种〔18〕：①氧化剂或亲电子试剂可以通过修饰Keap1上的半胱氨酸巯基来改变Keap1蛋白的构象，从而导致Keap1蛋白与Nrf2解耦联。②通过Nrf2的磷酸化使Keap1与Nrf2解耦联。通过细胞外信号途径如蛋白激酶C(PKC)、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-JunN端蛋白激酶(JNK)及P38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)等的活化使Nrf2上的苏氨酸和丝氨酸磷酸化，导致Nrf2构象发生改变，进而使得Nrf2与Keap1解耦联。但在这两种激活方式中，均因Nrf2-Keap1二聚体解耦联而导致Nrf2蛋白升高，都属于转录后修饰。因此，在Nrf2蛋白升高的同时Nrf2在mRNA水平却基本保持不变。③如纤维生长因子家族的成纤维细胞生长因子(FGF)-1、-7、-10，则主要是通过上调Nrf2 mRNA水平进而导致Nrf2蛋白表达升高，使得处于活性状态的Nrf2增多。

解耦联后的Nrf2由细胞质转移至细胞核，与其他NF(比如：c-Jun和小Maf蛋白)结合形成二聚体，从而识别ARE序列并与之结合，进而诱导其调控的靶基因表达下游的抗氧化蛋白和解毒酶，以保护机体免受活性物质(如氧自由基)及一些毒性物质(如致癌物、药物代谢活性产物等)的侵害。Nrf2-ARE调控的分子主要是细胞内的保护蛋白，如Ⅱ相解毒酶、SOD、还原型辅酶1(NQO1)，抗氧化酶、谷胱甘肽(GSH)合成代谢相关酶、抗炎蛋白等〔19〕。

3 Nrf2-ARE信号通路与ALS

3.1氧化应激与ALS 在ALS病人尸解的生物化学和组织病理学研究中显示，在ALS患者体内存在着脂质过氧化〔20〕、核酸氧化、蛋白糖基化、蛋白硝化及与蛋白相结合的羰基水平明显增高〔21〕等氧化应激的证据。在ALS病人血浆和脑脊液检查中也发现了8-羟基-2-脱氧乌苷酸(8OHDG)、4-羟基王烯醛(4-HNE)、硫代巴比妥酸反应(TBARS)、3-硝基酪氯酸(3-NT)等这些氧化应激产物的增加。有学者〔22〕在fALS病人体内发现了抗氧化酶Cu/ZnSOD1的突变。这些都充分说明了氧化应激确实参与了 ALS 的发病。但目前，针对氧化应激是否是神经元变性的主要原因或者是它仅仅是其他毒性损伤所致的结果，这一点仍不明确。对于病因已经明确的hSOD1突变转基因动物，其毒性致病机制也仍不清楚，目前大部分学者认为，SOD1活性的丢失并不足以导致疾病的发生，很可能是由于SOD1的突变形成了新的突变酶，产生了未知的新功能从而对细胞有毒性损伤作用。而且研究表明，突变的hSOD1产生的毒性并不仅仅局限于对运动神经元细胞，它还涉及其他类型的细胞，因此，运动神经元的存活需依靠不同类型的细胞之间的相互作用〔23〕。

3.2Nrf2与ALS 在体外或动物实验研究中，许多抗氧化剂已经表现出了对运动神经元的保护作用，而在这一过程中Nrf2蛋白是一个关键分子。Nrf2/ARE 通路下游的抗氧化酶和抗氧化蛋白包括 NQO1、谷胱甘肽硫转运酶(GST)、血红素氧合酶1(HO-1)和铁蛋白在内源性抗氧化过程中发挥了重要的作用。Nrf2蛋白的表达早已在神经变性疾病病人尸解的大脑组织中进行过研究，并且发现，在这些疾病中Nrf2受到损伤，而且在Nrf2-ARE信号通路中由于受损的Nrf2而导致细胞对抗氧化应激损伤的防御能力下降，增加了运动神经元在应激诱导的毒性损伤中的易损性〔24〕。几项研究报告表明〔25〕，破坏了Nrf2分子及其下游信号通路会进一步加重恶化细胞内的氧化损伤、炎症反应和线粒体功能障碍。在ALS尸解的大脑和脊髓组织中也发现，Nrf2的mRNA水平降低而Keap1的mRNA水平是升高的〔26〕。而应用Ⅱ相酶诱导剂干预ALS体外器官脊髓培养模型，可激活Nrf2-ARE通路，诱导NQO1、HO-1等表达上调，降低氧化应激水平，对苏-羟天冬氨酸(THA)诱导的选择性运动神经元损伤具有明显保护作用〔27，28〕。Neymotin等〔29〕在运动神经无样细胞(NSC)-34 G93A SOD1细胞模型中研究发现，未加干预的细胞内Nrf2的活性只有轻微的上调，而且Nrf2没有转位到细胞核中。但是，当给予细胞CDDO-TFEA培养发现，NRF2会转位到细胞核中，而且在Western印迹中也发现，NRF2调控的下游蛋白分子(NQO1、HO-1、GST-α3)表达增加；与之相符的是，在细胞免疫组化和RT-PCR结果分析中也出现下游蛋白的表达上调。紧接着他们又在转基因小鼠模型研究中发现，在接受CDDO-EA和CDDO-TFEA治疗的小鼠脊髓切片中，NQO1、HO-1和GST-α3等抗氧化基因上调，而与神经炎症相关的基因〔比如：绣导型-氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶(COX)-2、Fas配体(Fasl)、肿瘤坏死因子(TNF)-α等〕出现下调。而且与对照组相比，治疗组的小鼠的运动性能明显提高，体重下降也明显减少，更重要的是可以延长转基因小鼠的生存时间。最近Vargas等〔30〕研究也表明，在神经元细胞或是在Ⅱ型骨骼肌纤维细胞中Nrf2有限的过表达能够延迟ALS发生，但是不能够延长其生存时间。这些证据表明，Nrf2-ARE信号通路在ALS中可以对抗氧化应激损伤，保护神经元，同时，也为其成为潜在的ALS治疗靶点提供了依据。

众所周知，神经胶质细胞对于其相邻的神经元具有支持、营养及调节细胞生长和兴奋性的作用，并且与神经元相比，胶质细胞具有更强的抗氧化损伤的能力。星形胶质细胞抗氧化功能障碍已经在一些神经变性疾病中被发现，在ALS研究证据表明〔31〕，星形胶质细胞可以向细胞外间隙分泌GSH，而且之前在许多不同的模型研究中也已表明〔32〕：GSH水平升高可能是导致Nrf2激活发挥保护作用的一个重要原因，因而可以增高星形胶质细胞周围的神经元抗氧化防御能力，从而保护神经元。最近有报道，在ALS老鼠模型的脊髓运动神经元中，氧化型GSH水平增加而还原型水平在降低〔33〕，并且在相同模型中发现，GSH减少能够加剧神经功能损伤和线粒体病理性改变〔34〕。研究发现，Nrf2-ARE通路激活剂特丁基对苯二酚(tBHQ)能够显著增加星形胶质细胞内GSH的合成和分泌，抑制神经营养因子的低亲相力受体(p75NTR)依赖的共培养运动神经元的凋亡〔35〕。最近，Vargas等〔36〕发现，SOD1突变的星形细胞对周围的运动神经元具有ALS的毒性作用，而星形细胞在胶质酸性蛋白诱导下的Nrf2高表达则可逆转这种毒性，并且明显提高了小鼠的生存时间。因此，目前这些数据表明，可以试图激活星形胶质细胞内Nrf2-ARE通路来保护运动神经元免受氧化应激损伤。在 ALS 病人运动神经元中异常线粒体的形态已经得到了病理学上的证实〔37〕。线粒体损伤可以使得氧自由基的产生增多。在不同类型的细胞中，线粒体的损伤可能引发一系列不同的反应。比如，在星形胶质细胞中，线粒体的损伤会产生促炎分子，这对神经元细胞及其他周围的细胞会产生毒性损伤。炎症反应又会加重神经元在氧化应激中的损伤。在中枢神经系统中，氧化应激和炎症反应又会破坏线粒体和其他细胞器，最终形成一个恶性循环导致神经元变性、死亡〔38〕。据报道〔39〕，Nrf2能够调节线粒体生成的启动基因，如线粒体转录因子，能够直接参与对线粒体的保护作用，从而减少氧化应激反应。

神经炎症反应作为神经变性疾病受累组织中的一个特征性改变，主要表现为小胶质细胞的大量激活和星形胶质细胞局部反应性聚集及相应炎性因子的改变。这种炎性反应与神经元氧化损伤、线粒体功能障碍及蛋白质异常聚集相关，因此调节神经炎性反应可以对疾病的进展产生影响〔40〕。David 等〔41〕应用免疫组化法研究转基因小鼠，证明在 ALS 发病早期，脊髓及其周围神经就有小胶质细胞的聚集，并伴随着下运动神经元的胞体及轴突病变。但是，在炎症过程中，COX-2、iNOS等抗炎作用仅仅是部分依赖Nrf2通路的诱导，其抗炎效能与Nrf2的诱导之间的关系仍然需要进一步明确〔42〕。

4 展 望

众多研究表明，Nrf2-ARE信号通路在ALS中具有神经保护作用，但是它所介导的一系列抗氧化机制，是疾病的发病机制还是继发于疾病出现及与其他发病机制之间的关系，还有待进一步研究。目前，虽然有较多的Nrf2激动剂，但寻找对人体安全有效且能顺利透过血脑屏障的药物仍是一大挑战。随着研究的深入开展，或许Nrf2-ARE信号通路能够为ALS治疗提供新的思路。

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