DNA甲基化及测定方法

史双林

(北华大学检验学院，吉林 吉林 132013)

在真核生物中，甲基化只发生在胞嘧啶第五位碳原子上，由DNA甲基化转移酶(DNMT)催化，以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)的一种反应。其可保护DNA不被限制性内切酶切开。在人类基因组中，DNA的胞嘧啶约有4％被甲基化，它与基因表达有重要关系。活性染色质DNA呈低甲基化。60％～90％ CpG二核苷酸的胞嘧啶是甲基化的，主要散布在DNA重复序列。管家基因和组织特异性基因的5′端，启动子和第一个外显子区，由CpG密集(C+G>50％)而成，长度为1 000～2 000 bp，称为CpG岛，通常是非甲基化的，其甲基化可抑制转录，基因静默。DNA甲基化与研究在非DNA序列改变的修饰，影响基因表达的可遗传的表观遗传学密切相关。其与组蛋白乙酰化在基因表达调控中的作用，与肿瘤、衰老、分化等一系列医学生物学问题有关〔1～4〕。

1 DNA甲基化

1.1DNA甲基化谱的建立 DNA甲基化分为2种：维持甲基化和从头甲基化。维持甲基化是当甲基化的双链DNA复制后，在DNMT1作用下，生成的两条新链中，只有亲代链是甲基化，而新合成的子代链是非甲基化的。DNA整体甲基化主要与DNMT1相关，对生物DNA甲基化表型起维持作用。从头甲基化则是在完全去甲基化的位点引入甲基，在从头甲基化酶DNMT3a和DNMT3b催化下，建立甲基化机制。在早期胚胎和胚胎期肿瘤(EC)的细胞中，DNMT1完全失活，基因组完全去甲基化，此后DNMT3a和DNMT3b催化下，基因组开始重建甲基化谱。其建立过程就是细胞分化的完成过程，也是细胞部分或完全丧失分裂能力的过程。具有组织特异性，甲基化谱不同的细胞其功能也不同〔1〕。

1.2DNA甲基化可改变DNA构象，影响蛋白质与DNA的结合 DNA甲基化后由于甲基在DNA双螺旋深沟中暴露在外，改变了DNA的构象，影响其与蛋白质分子的相互作用，呈空间位阻效应。DNA通常以B型状态存在，右手螺旋。当高度甲基化时，以Z型状态存在，左手螺旋，比B型较为细长。Z-DNA的抗原性较强，可以免疫家兔制备抗体。利用Z-DNA抗体即可检测Z-DNA的存在〔2，3〕。

基因启动子部位甲基化使甲基-CpG结合蛋白(MeCPs)附着，从而直接妨碍启动子与转录因子(Sp1，E2F)，核因子(NF)-κB等结合，抑制转录。1989年在细胞核提取物中发现了与DNA甲基化有特异亲和力的蛋白质MeCP1，它可以识别至少12个或更多对称性的CpG位点形成复合体。为一个大的多亚单位复合物，其中结合结构域(MBD)2结构域介导了复合物与DNA甲基化的识别。随后发现了结合单一CpG位点的MeCP2，有特异性，比MeCP1丰度高。MeCP2有两个重要结构域：一是甲基化CpG MBD，与启动子甲基化CpG结合；另一个是转录抑制结构域(TRD)，可招集转录抑制子(Sin3)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，形成转录抑制复合物，抑制转录〔3～5〕。

组蛋白乙酰化发生在核小体八聚体组蛋白N末端，即碱性氨基酸残基集中区，使赖氨酸残基ε-NH2带上正电荷，组蛋白和DNA之间的静电引力减弱，降低亲和力，有利染色质重塑和转录起始。组蛋白共价修饰(乙酰化、 甲基化、磷酸化等)、DNA甲基化、转基因等机制在不同的基因调控中，彼此之间相互影响，形成“串话”，并按照一定的顺序发挥作用〔6，7〕。

在DNA甲基化研究了60多年后，进入本世纪才确定了其在人类疾病的重要作用。Rett综合征(RS)是一种严重影响儿童精神运动发育的疾病，(1～2.2)万女婴中散发1例。MeCP2基因突变是RS致病的分子基础，MeCP2基因位于人类染色体(Xq28)，转录翻译生成MeCP2蛋白，此蛋白通过调控脑源性神经营养因子(BDNF)的表达而影响神经元可塑性，进而引起脑发育障碍、记忆、认识、运动功能落后。BDNF基因有4个启动子，在其表达前后MeCP2结合在BDNF启动子Ⅲ上游-150的甲基化位点抑制启动子Ⅲ，如果MeCP2蛋白突变则BDNF基因表达受到抑制〔8，9〕。

1.3DNA甲基化与基因印记、X-染色体失活、脆性X染色体综合征密切相关 哺乳动物，子代基因分别来自父、母的2个等位基因，活性不同。胰岛素样生长因子(Igf)2来自父本的等位基因表达良好，来自母本的等位基因无活性，不表达。这种现象称为基因印记。Igf2基因为母源印记，父源表达。因为在父源遗传中，鼠7号染色体Igf2基因下游的印迹控制区(ICR)蛋白结合位点被甲基化不能结合特异蛋白(CTCF)，失去阻碍作用，使下游的增强子可越过ICR直接激活远端的Igf2基因。也可相反，例如H19基因是父源印记，母源表达〔10，11〕。

X染色体很大，含有全部DNA的6％，Y染色体通常很小。尽管男性仅有一条X染色体，但是编码的基因产物如红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)活性平均量与有两条X染色体的女性相同。但在此酶缺欠的个体中，男性患者多于女性。因此，肯定存在某种剂量补偿机制。正常雌性哺乳动物体细胞中，2条X染色体中有1条上的大多数基因在遗传表达上是失活的。X失活发生在胚胎早期，是随机的(可来自父本或母本)。X失活是广泛的，X染色体上1/3的基因可能逃避。多数体细胞X失活是永久的，但在生殖细胞发育中，必须是可逆转的。其机制涉及染色质结构的改变，包括DNA差异性甲基化和组蛋白乙酰化。在失活X染色体上，沉默基因5′上游区域内的CpG岛高度甲基化，而染色体上的同源序列则是非甲基化的〔12〕。

脆性X染色体综合征患者染色体上发现有1个叶酸敏感位点。(FMR)1基因，即脆性X染色体智力低下基因，位于Xq27.3，长38 kb，包含17个外显子，可能编码一种RNA结合蛋白。在非翻译的第1外显子内发现了1个CGG三核苷酸的重复序列，正常情况下其长度为6～50个重复次数，平均为30。在此症受累患者中，这种CGG重复极度扩展至几百甚至几千。当重复次数超过大约230时，FMR1基因5′端高度甲基化，转录关闭。FMR1 mRNA和蛋白质的缺乏被认为是造成这种综合征临床表现的原因。

1.4DNA甲基化与衰老的关系 基因组总体低甲基化，局部高甲基化是衰老时DNA甲基化的典型表现。这与DNA甲基化酶总活性降低有关。衰老可影响DNA甲基化，DNA甲基化也可影响衰老。某些基因启动子的CpG岛甲基化增高。测定体外培养的人二倍体成纤维细胞，小鼠细胞中DNA的5mC的含量，结果均表明其甲基化程度随细胞代数的增高而降低，而且细胞5mC丢失的速率与其寿限(可传代龄)密切相关〔2〕。

衰老时DNA甲基化变化具有不均一性。检测不同代龄人成纤维细胞DNA的卫星(Sat)2和Sat 3的甲基化状态，结果表明：Chr1、Chr 9和Chr 16的近着丝粒异染色质富含Sat2和Sat3。Sat3的DNA甲基化降低速度比Sat2和总体DNA快2倍。他们认为这种降低可增加染色体重排的可能性，这种染色体不稳定性是复制性衰老的原因之一〔2〕。

DNMT1抑制剂5-杂氮-2脱氧胞苷酸和5-杂氮胞苷酸，为胞嘧啶衍生物，可降低DNA甲基化水平，促进衰老。

1.5DNA甲基化与肿瘤的关系 肿瘤细胞中常有DNA整体甲基化水平下降，主要是重复序列的去甲基化，导致整个基因组不稳定及特定序列高甲基化并存的现象，这与异常的DNMT有关。一些癌基因通过去甲基化而被激活；一些抑癌基因启动子CpG岛高甲基化使其失活，诱发癌症。高度、中度重复DNA序列低甲基化，包括异染色质的卫星DNA LINE-1，人内源性逆转录病毒(HERV)-K家族，NBL1等。在慢性淋巴细胞白血病、膀胱癌、肝癌等均观察到LINE-1低甲基化。LINE-1为高度重复序列，散布的反转录转座子，人类基因约15％由其构成，长度6 kb以上，大约40万拷贝，可将遗传信息准确地插入某些特定位置，以DNA-RNA-DNA方式转座。甚至拷贝数高于LINE-1的Alu序列也低甲基化，其占人类基因组大于10％，长度约0.3 kb，大于100万拷贝，它也能移动，偶尔引导癌症相关基因插入。在乳腺癌，卵巢上皮细胞癌，Wilms肿瘤中，Chr1着丝粒主要DNA构件Satα及在近着丝粒区，BstBI位点低甲基化，Chr1 Sat2和Chr16 Sat2 低甲基化。肝细胞癌中，Chr9长的近着丝粒区主要构件Sat2和Sat3均低甲基化〔13〕。

DNMT3b基因突变会引发罕见的常染色体隐性遗传(ICF)综合征。由于DNMT3B基因失活，阻断了从头甲基化，使重着丝粒异染色质的主要构件典型的Sat2和Sat3 低甲基化，引起一种罕见的精神，面部失常症状〔1，8，13〕。

最新的一项研究显示，由幽门杆菌(PY)感染引发的胃癌，在不同靶细胞Alu和Satα低甲基化；LINE-1仅在原发性胃癌低甲基化，人胃癌不总是基因组低甲基化〔14〕。

近些年研究成果阐明了为何三苯氧胺(tamoxifen)治疗乳腺癌的同时导致子宫内膜癌这一长期倍受公众和科学界关注的重要问题。Tamoxifen不仅影响雌激素相关靶基因的表达，而且调控一些独特的基因，PAX2基因在介导雌激素(E2)和Tamoxifen刺激的子宫内膜细胞增殖和癌变过程中起着关键作用。在癌变的细胞中，PAX2基因启动子低甲基化，E2激活E2受体(ER)与Sp1、共激活子形成转录复合体，促进基因表达。而在正常子宫内膜上皮细胞中，PAX2基因高甲基化特异性结合MeCP2与SIN3A、HDAC共同形成转录抑制复合物，ER不能被E2激活，抑制转录。这一发现为子宫内膜癌的治疗和预防提供了新的思路和药物靶点〔15，16〕。

在肿瘤的起始及进展过程中，DNA甲基化和组蛋白去乙酰化是改变表观遗传创建新治疗方法的重要靶点。与基因改变的不可逆性相比，肿瘤表观遗传学改变是可逆的。5-杂氮胞苷酸和5-杂氮2脱氧胞苷酸是研究最广泛的DNMT抑制剂。作为核苷酸类似物在DNA复制时，掺入到自然胞嘧啶碱基位置，这仅发生在S期。一旦掺入到DNA上，复合体会形成DNMT的活性位点，共价结合捕获DNMT，降低酶的活性，在几次细胞分裂后，DNA去甲基化，沉默的抑癌基因重新活化。5-杂氮胞苷酸也可以掺入到RNA，干扰蛋白质的翻译，对酶的抑制更加有效。它们也可作为血管生成抑制剂，抑制肿瘤上皮细胞和血管生成。(Zebularine)是新的DNMT抑制剂，非常稳定，适合口服，毒性小，对肿瘤细胞有高选择性。Procainamide、Epigallocathechin-3-gallate、MG98等也具有类似作用〔17〕。

2 DNA甲基化检测方法

2.1亚硫酸氢钠法 亚硫酸氢钠法的基本原理是：亚硫酸氢钠可以通过磺酸基作用使胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，后者经PCR扩增变成胸腺嘧啶T，形成T：A的配对。但甲基化的胞嘧啶并未改变。甲基化状态不同的DNA片段就转化为有碱基序列差异的两个片段。这种差异可以用DNA测序，或者联合限制性内切酶分析法，或者是进行不同引物的PCR扩增等方法来把它们显示。

2.1.1亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法〔18〕

2.1.2亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA) 样本经亚硫酸氢钠处理后，某些碱基序列的改变可以产生新的限制性内切酶图谱。为调查类固醇17-α-羟化酶CYP17A2基因-2544～-1522的甲基化状态，处理基因组后，PCR产物产生新的限制性内切酶位点，Fokl识别GGATG，EcorⅠ识别GAATTC，Acil识别CCGC，Dral识别TTTAAA。酶切PCR产物，以鉴别。这种方法工作量和耗费相对较小，快速，但只能获得特殊酶切位点甲基化的信息〔19〕。

2.1.3甲基化特异性PCR(MS-PCR) 目的片段经处理后，设计甲基化和非甲基化两种引物，样本DNA根据自身的甲基化状态在相应的PCR组中得到扩增，甲基化引物含有3个CG，靠近3＇端，结果凝胶电泳图像显示出来。此方法对测定多种肿瘤抑癌基因(p16，p15，E-cadherin等)具重要性。为增加MS-PCR 的灵敏度，采用巢式PCR，设计两对引物，一对引物对应的序列在模板的外侧，为外引物(M2，U2)，另一对互补序列在同一模板的外引物的内侧，为内引物(M，U)。此法特异性高，工作简单，耗费和耗时都较小〔20〕。

2.1.4甲基化敏感的单核苷酸扩增法(Ms-SNuPE) 可快速判断DNA片段中某些具体位点的甲基化状况，定量分析。DNA样本经处理，PCR扩增，凝胶电泳分离目的片段。在p16基因5＇端CpG岛选择3个转录起始位点，分别设计引物，使引物的3＇端紧邻被检测的碱基上。然后把该引物、Taq酶、PCR产物和32P标记的dCTP作为PCR体系混合扩增。如果该位点发生了甲基化，放射性的dCTP将进入合成的序列，产物经电泳分离，放射性成像即可显示。而如果没有甲基化，该位点经处理转变为T，32P-dCTP无法进入，条带为阴性。再检测另一组非甲基化，将32P-TTP掺入，又可得到阳性条带。测定C：T信号比值。通过放射性强度来定量分析，并能检测不对称甲基化。但不能对较长序列进行全面的考察，多位点检测需要设计较多的引物。用到放射性物质也是其缺陷之一〔21〕。

2.2甲基化敏感的限制性内切酶法 一些限制性内切酶含有CpG双核苷酸序列识别位点，它们往往只识别甲基化的序列，而对非甲基化没有活性，这类酶中比较重要的BstUⅠ、NotⅠ和SmaⅠ。以此设计许多方法。

2.2.1甲基化敏感的限制性图谱(MSRF) 将目的片段或基因组分为两份，两者均用MseⅠ(甲基化不敏感的酶，识别TTAA)处理，将大片段切割成适当大小片段，并且其中一份加入BstUⅠ(甲基化敏感的酶，识别CGCG)，设计引物为10个核苷酸，其3＇端为CGCG，进行PCR扩增，最后把两份样本电泳分离，对照。在MseⅠ组和MseⅠ/ BstUⅠ组中同时出现的条带就是甲基化位点出现的部位。若进行基因组DNA检测，还应进一步作Southern杂交以分离和确认〔22〕。

2.2.2限制性标志物全基因组扫描(RLGS) 可同时分析2 000个以上片段的甲基化情况，基因组DNA以Landmark酶消化，此酶为关键酶，常用甲基敏感的NotⅠ(GC↓GGCCGC)或AscⅠ(GG↓CGCGCC)，切割频率低且识别序列至少含2个CpG位点。切割后放射性标记末端。再以EcoRⅤ(甲基不敏感，切割频率较NotⅠ高)消化产生较短的NotⅠ-EcoRⅤ片段，电泳展开。然后，用HinfⅠ(甲基不敏感，切割频率较EcoRⅤ高)在凝胶内消化，产生更短的片段。将凝胶旋转90°第2次电泳，显影成RLGS图谱。两个样本比较，样本中缺失的斑点为甲基化位点。计算机可快速识别缺失斑点，对基因组甲基化状态进行整体分析。集中考察非甲基化区域，避免了重复序列的干扰。需要大量的DNA，技术复杂〔23，24〕。

2.2.3差异性甲基化杂交分析(DMH) 肿瘤基因组DNA经MseⅠ TTAA消化为100～200 bp的小片段，其识别序列很少位于CG丰富区，保持了CpG岛的完整性，以用于构建CpG岛文库。正常基因组DNA也同样处理，富含CG片段的末端连上接头。消除重复序列。再以BstUⅠ CGCG消化。将MseⅠ和MseⅠ/BstUⅠ处理后片段分别进行PCR，得到MseⅠ和MseⅠ/BstUⅠ处理的扩增子。将其作为扫描高甲基化序列的探针。点样膜上制成高密度的CpG岛文库微阵列。将正常标本及乳腺癌ZR-75-1、Hs578t(A，B，C)32P标记的MseⅠ处理的扩增子在3个膜上进行杂交，以32P标记的MseⅠ/BstUⅠ处理的扩增子在另外3个膜上进行杂交(A＇，B＇，C＇)。成像可得到甲基化信息。应用高密度DNA阵列杂交，大通量，易自动化。但会造成假阳性结果。可克隆，测序或Southern杂交进一步证实〔25〕。

2.2.4甲基化CpG岛扩增子分析(MCA) 通过扩增2个相邻(<1 kb )SmaⅠ位点(CCCGGG)来富集甲基化的CpG岛。甲基化敏感的SmaⅠ识别CCCGGG序列，但并不切割甲基化位点，产生平端，随后以甲基化不敏感的SmaⅠ的同裂酶XmaⅠ消化，产生CCGG黏端，再连上接头，PCR扩增，得到MCA的扩增子。在尼龙膜上点样，以任何感兴趣探针进行斑点杂交，可半定量，肿瘤标本可检测到异常的甲基化扩增子。技术复杂，易受重复序列干扰〔26〕。

2.3化学测序法为基础的甲基化分析

2.4单核苷酸鉴定法

2.4.1相邻邻居法

2.4.2逆相高压液相层析(RP-HPLC) 5类核苷酸在极性溶液中的溶解度不同，在经过非极性的过滤柱时，溶解度高的dCMP随极性溶液先流出，而溶解度低的dAMP则在柱中停留时间长，后流出。它们出柱的顺序是dCMP、5mdCMP、dTMP、dGMP、dAMP。通常先用DNaseⅠ水解DNA片段，并装好非极性的硅胶柱(它使非极性的碳氢化合物化学结合到硅胶表面)。水解产生的单核苷酸溶液注入柱内，将流出的液体用紫外线吸光监测仪进行检测，记录结果输入电脑绘成吸光度-时间表。根据波峰的早晚及高度，测定出5类核苷酸的相对含量。可更准确分析基因组中甲基化的含量。需专门设备，DNA的纯度要求较高，不能混入RNA〔27〕。

2.5甲基接受力检测法〔28〕

2.6MBD柱分离甲基化CpG岛〔29〕

2.7基因表达阵列法 肿瘤中，抑癌基因的失活是基因启动子区高甲基化的结果。降低甲基化程度可以逆转基因表达，使其上调。用DNA甲基转移酶抑制剂(DAC)和HDAC抑制剂(TSA)处理细胞，将表达的基因片段用cDNA阵列法检测出来，与非药物处理组的结果相比较，就可获知某个基因启动子区发生甲基化情况〔30〕。

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