对乙酰氨基酚肝毒性机制与防治研究新进展

潘家琪，宋丹军，李鹏旭，刘爱明

(宁波大学医学院生理药理学系，浙江宁波 315211)

对乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol，APAP)(扑热息痛)是临床最常用的解热镇痛抗炎药，也是临床引起肝毒性的最常见的药物［1］。长期或过量使用APAP易导致急性肝功能衰竭。因此，APAP肝损伤受到广泛关注。近10年来，人们对APAP肝毒性发生过程中的细胞内分子事件有了更多的认识，炎症细胞和炎症因子在APAP肝毒性中也发挥重要作用。许多单体化合物和天然提取物对APAP肝毒性具有对抗作用。

1 APAP肝损伤的细胞内分子事件

1.1 APAP肝毒性的代谢激活和启动

APAP经吸收进入体内后，90%APAP与葡萄糖醛酸或硫酸结合后排泄，其余5% ～10%通过细胞色素 P450(cytochrome P450，CYP)系统，特别是 CYP2E1代谢产生 N-乙酰基-对-苯醌亚胺(n-acetyl-para-benzoquinone imine，NAPQI)，该毒性代谢物由谷胱甘肽(glutathione，GSH)解毒［2］。新的研究技术发现了其下游的代谢物，包括S(5-乙酰氨基-2-羟苯基)β-巯基丙酮酸、3，3-二聚APAP和苯并噻嗪化合物等［3］。一旦肝细胞内GSH被耗竭，NAPQI与蛋白质的巯基可发生反应形成APAP蛋白质加合物;蛋白质加合物的形成是关键性启动事件，它的进一步传播和放大才导致肝毒性［4］。

1.2 线粒体氧化应激与细胞损伤的扩布

APAP过量与线粒体呼吸抑制、肝ATP耗竭及线粒体氧化应激有关［5］。尽管APAP过量导致活性氧的形成增加，但脂质过氧化作用并不被认为是细胞损伤的关联机制［6］。相对而言，坏死肝细胞中硝基酪氨酸蛋白加合物染色呈阳性，提示过氧化亚硝酸盐的形成［7］。APAP过量使用后，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)会产生一些NO，这些NO与过氧化物快速反应形成过氧化亚硝酸盐。由于超氧负离子不易透过生物膜，过氧化亚硝酸盐形成主要发生在线粒体中。虽然GSH可有效清除过氧化亚硝酸盐，但APAP暴露后胞浆内和线粒体内的GSH会大量消耗，肝细胞将不受保护。过氧化亚硝酸盐与蛋白质反应，致线粒体中的酪氨酸硝基化［8］。活性氧和过氧化亚硝酸盐至少部分参与对线粒体DNA的损伤和线粒体膜孔的开放，从而触发线粒体膜电位崩溃，诱导细胞坏死;迅速恢复线粒体GSH水平，过氧化亚硝酸盐就会被有效清除，并减轻细胞损伤［9］。这些数据表明，过氧化亚硝酸盐确实是APAP肝毒性的关键性介质。

1.3 核DNA断裂与APAP的肝毒性

除了线粒体功能障碍外，DNA断裂继发核溶解是APAP诱导的肝损伤机制中另一早期现象。DNA断裂由琼脂糖凝胶电泳实验首次发现，随后用TUNEL等方法证实［10－12］。由于 APAP 并不引起胱天蛋白酶酶系的活化，前述DNA断裂并不等同于细胞凋亡中的DNA断裂;它们的着色模式和碎片大小等有根本的差异。虽然核酸内切酶抑制剂的细胞保护作用表明毒性过程中DNA断裂，但多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶〔poly(ADP-ribose)polymerase，PARP〕并没有参与。PARP过度激活导致细胞内NAD+和ATP耗竭，从而启动细胞坏死。然而，在 APAP肝毒性期间，PARP激活多发生在APAP给药后6～12 h之间，此时细胞已经处在坏死过程中。动物实验发现，与PARP野生型小鼠相比，APAP 肝毒性在 PARP－/－小鼠表现加重［13］，表明PARP在APAP肝毒性中确实发挥了重要作用。

最近研究表明，氧化应激/过氧亚硝酸盐介导的线粒体功能障碍导致核DNA断裂［8］。APAP过量早期，Bcl-2家族成员 Bax易位到线粒体;在Bax－/－小鼠中，线粒体氧化应激水平变化不大，但细胞色素c从线粒体膜间的释放被延迟，DNA断裂和肝损伤也被延迟。后期的毒性损伤和DNA断裂在野生型小鼠和Bax－/－小鼠之间无区别。上述结果表明，Bax易位触发线粒体蛋白质的提前释放，这可能会促使核DNA断裂，但后期过氧化亚硝酸盐损伤发生时，Bax的影响就会降低。

1.4 c-Jun N 端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路与APAP肝毒性

APAP 5，10 和 20 mmol·L－1与人原代肝细胞孵育，3 h内细胞内GSH迅速衰竭，同时导致早期APAP蛋白质加合物形成和线粒体功能障碍;24 h后肝细胞开始浓度依赖性地坏死。此外，APAP还时间依赖性地触发JNK在细胞质中的活化，使磷酸化的JNK易位至线粒体。APAP干预后，用JNK抑制剂SP600125处理3 h可降低JNK活性，并显著减少细胞死亡［14］。别嘌醇预处理小鼠可以有效地防治APAP的肝毒性，提前1和18 h给予别嘌醇，给予APAP后早期(2 h)JNK均被激活;提前18 h给予别嘌醇，给予APAP 6 h后JNK激活减弱;表明后期JNK的活化对毒性更为关键［15］。上述研究表明，APAP过量后JNK信号通路在肝损伤过程中发挥关键作用，提示JNK信号通路可能为潜在的临床毒性防治的靶点。

1.5 肝细胞代谢功能的变化

基于高分辨率核磁共振技术的代谢组学研究表明，APAP 500 mg·kg－1导致小鼠线粒体的三羧酸循环无法利用丙酮酸盐，同时肝线粒体中脂肪酸β氧化作用减弱［16］。在另一项基于液质联用技术的代谢组学研究中，APAP 400 mg·kg－1通过CYP2E1介导的代谢活化和氧化应激可导致脂肪酸氧化作用的不可逆抑制，表现为长链脂肪酸代谢物及其代谢基因表达水平的变化［17］。在APAP诱导肝毒性期间，过氧化物酶体增殖物激活受体α的靶基因诱导编码线粒体UCP2防止活性氧产生增多，同时提示UCP2的诱导也可能是脂肪酸β-氧化过程中对线粒体保护的重要机制［18］。上述结果表明，线粒体β氧化功能损伤是高剂量APAP肝毒性发生过程中的重要环节。

2 APAP引起肝损伤期间的炎症反应

APAP导致肝细胞肿胀死亡，这包括最初12 h内巨噬细胞和淋巴细胞的激活，中性粒细胞(4～24 h)和单核细胞(24～48 h)在肝内的募集。在APAP的肝毒性期间，通常认为广泛的无菌性炎症是有益的，被激活的炎症细胞不仅参与去除坏死的细胞碎片，还可以限制促炎介质的形成和作用，同时促进组织修复［19］。

2.1 Kupffer细胞和巨噬细胞对APAP肝毒性的作用

大鼠给予 APAP 1200 mg·kg－1后，Kupffer细胞被激活，单核细胞在24 h内募集进入肝;使用外源药物灭活巨噬细胞能够减轻肝损伤［20］，该保护作用在小鼠APAP毒性模型中也有报道。氯化钆等灭活Kupffer细胞主要通过降低活性氧实现［21］。然而，这种解释也存在一些问题，首先，大多数活跃的Kupffer细胞都位于门静脉周围区域，远离小叶中心过氧化亚硝酸盐形成的位置和肝损伤的位置［22］。其次，参与巨噬细胞中过氧化物产生的糖蛋白gp91phox缺陷的小鼠和野生型小鼠中，肝损伤和氧化应激水平相似［23－25］。因此，虽然 Kupffer细胞在APAP肝毒性中发挥了重要作用，但尚不能肯定它就是APAP肝毒性时氧化应激和过氧化亚硝酸盐的来源。

2.2 炎症介质对APAP肝毒性的作用

在Kupffer细胞耗竭的小鼠中APAP诱导的肝损伤加重，这与白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)和IL-6的衰减有关［23］。APAP肝毒性中，IL-6促进肝细胞再生，而IL-10则限制炎症因子肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和 IL-1 的形成。这些炎症因子促进iNOS表达，增加过氧化亚硝酸盐的形成，加重肝损伤。IL-10－/－小鼠中致炎细胞因子形成增加，iNOS表达增加和细胞损伤加重等结果支持了上述结论［26］。本课题组最近研究发现，小鼠经APAP诱导肝毒性后，阳性对照组IL-6显著升高，信号转导蛋白和转录活化蛋白3(signal transducerand activator oftranscription 3，STAT3)被激活，其下游靶基因细胞因子信号抑制因 子 3(suppressorofcytokinesignaling 3，SOCS3)等表达增加，表明IL-6-STAT3-SOCS3炎症信号通路参与了APAP肝毒性的发生(待发表)。

APAP过量使用后4～24 h，致炎细胞因子TNF-α和 IL-1产生，拮抗 TNF-α或 IL-1能减弱APAP诱导的肝损伤［25］。据报道，在TNFⅠ型受体基因敲除(TNFR1－/－)小鼠中也表现类似的保护作用。因此，这些细胞因子的促损伤作用被认为与iNOS的诱导和其他炎症介质的形成有关;但也有报道APAP使用后8 h内TNF－/－小鼠和野生小鼠肝损伤程度相似［28］;另一项研究中，APAP 300 mg·kg－1导致TNFR1－/－小鼠较野生型更严重的肝毒性，磷酸肌醇3激酶的活化被延缓6～12 h［29］。因此，APAP引起组织损伤时TNF-α通过TNFR1发射信号在调节肝细胞增殖中非常重要。

诱导型热激蛋白(heat shock protein，HSP)如HSP70能有效地对抗APAP诱导的肝损伤。APAP诱导环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)增加前列腺素形成。COX-2－/－小鼠或用COX-2抑制剂处理的动物对APAP更敏感，且增加的肝损伤与HSP诱导缺损有关。相反，在APAP使用后，巨噬细胞移动抑制因子缺陷(MIF－/－)小鼠仅有轻微的损伤，这与HSP大幅增加相关［30］。

干扰素 γ(interferon-γ，IFN-γ)是病理生理过程中另一个炎症介质。APAP导致IFN-γ大量形成，在 IFN-γ－/－小鼠中 APAP 肝损伤减轻，中和IFN-γ能减少细胞因子、趋化因子和NO的形成，减少白细胞浸润。然而，目前仍不清楚其参与保护作用的机制。由于自然杀伤细胞是IFN-γ的主要来源，在自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞缺陷的动物中也观察到类似的保护作用［31］。但这些研究中炎症组织损伤的机制仍不清楚。

2.3 APAP肝损伤中的组织再生

肝细胞损伤会触发组织再生;在临床和实验研究中，再生反应初期可以限制整体上的损伤和预防肝衰竭。TNF-α是毒性肝损伤和APAP肝毒性时诱导肝细胞再生的重要介质，TNF-α同时能刺激IL-6的形成［32］。IL-6可促进再生和诱导保护性HSP的表达。该信号机制涉及磷酸肌醇3激酶和Akt的激活，从而使STAT3活化;SOCS3过表达可以加剧APAP肝毒性，STAT1激活增强，STAT3激活下降，同时 IFN-γ 和 TNF-α 升高［33］。在体内和体外培养肝细胞中，APAP过量使用后，中性粒细胞激活的活化肽78、IFN-γ诱导蛋白10和IL-8等均促进肝组织再生，且效果显著［34－35］。虽然这些趋化因子能有效地减少后续损伤，但具体的分子机制还有待研究。

2.4 中性粒细胞在APAP肝毒性中的作用

中性粒细胞在APAP肝毒性中的作用仍然有争议。APAP给药后4～24 h，大量中性粒细胞募集至肝;中和中性粒细胞上β2整合素并不能防止APAP所致的肝损伤。很多研究并不支持中性粒细胞在APAP肝毒性机制中的作用，反而提示中性粒细胞参与去除受损细胞或细胞碎片［36］。也有些研究间接提示，中性粒细胞可能参与了APAP诱导的肝毒性;IFN-γ－/－小鼠和自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞耗竭的小鼠中APAP肝毒性减轻，中性粒细胞减少［31，37］。目前的实验证据并不支持中性粒细胞在APAP肝毒性病理生理过程中的细胞毒性效应。

3 APAP肝毒性的防治策略

3.1 基于对抗 APAP毒性代谢物通路的肝毒性防治

NAPQI是 APAP产生毒性主要中间体。C57BL/6小鼠中，吲哚衍生物 NecroX-7降低APAP诱导的JNK磷酸化和3-硝基酪氨酸的形成;也可直接结合NAPQI减少APAP引起的肝损伤。与N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)相比，NecroX-7显示了更强的预防和疗效作用［38］。

GSH前体NAC提前给药保护APAP肝毒性是通过提高清除 NAPQI进行的。小鼠给予 APAP(300 mg·kg－1)1.5 h之后使用 GSH 和 NAC 干预，活性氧和过氧化亚硝酸盐水平明显减少，且GSH(－82%)的保护作用强于NAC(－46%);而增加NAC的剂量可以达到与GSH相当的保护作用，说明NAC的保护作用中除了供应GSH的合成需要，多余的NAC参与恢复ATP能量供应［39］。在SD大鼠APAP(800 mg·kg－1)肝毒性模型中，相同摩尔剂量(2.4 mmol·kg－1)的NAC、次牛磺酸和牛磺酸显示了同等的保护作用，尽管它们的结构和体外抗氧化活性不尽相同;它们的保护作用均表现为氧化应激水平和GSH代谢体系的改变，虽然次牛磺酸和牛磺酸不参与GSH的合成，但在维持GSH水平、GSH与氧化型GSH比例上却与NAC功能相当［40］。

在小鼠模型中，韩国红参(Korean red ginseng，KRG)能够降低 APAP的 LD50，降低转氨酶活性，改善肝组织病理变化。作用机制研究发现，KRG通过抑制CYP2E1和诱导谷胱甘肽S-转移酶A2(glutathione S-transferase alpha 2，GSTA2)改变APAP代谢，破坏GSTA2对GSH的催化作用可逆转KRG的作用。人参皂苷Rg3可激活GSTA2的转录并增加GSTA2蛋白的表达。基于KRG能有效的防止APAP诱导的肝毒性，而皂苷Rg3是KRG的主要成分，人参皂苷Rg3可能是一种潜在的护肝剂［41］。由上可见，GSH耗竭是APAP肝毒性发生的始动因素，直接补充GSH或增加GSH的合成代谢是当前防治APAP肝毒性的主要策略。

3.2 基于促进能量代谢的肝毒性防治

每天给小鼠腹腔注射氯贝特500 mg·kg－1，连续10 d，小鼠肝GSH含量显著增加，并且APAP引起的蛋白质芳基化、GSH耗竭及肝细胞坏死明显减少。提前24 h单次给予相同剂量氯贝特也具有良好的保护作用，但与上述多剂量给药的保护作用不同，单剂量给药没有通过控制蛋白质芳基化和GSH水平产生保护作用［42］。氯贝特对APAP肝毒性的保护与早期增加APAP-GSH加合物在胆汁排泄物中的浓度有关，说明氯贝特的保护作用也发生在APAP的代谢环节。同样是 PPARα激动剂，Wy-14643和非诺贝特也被证实对APAP引起的肝毒性具有充分的保护作用，且保护作用通过过氧化物酶体增殖物激活受体α的靶基因UCP2产生，其调控的下游环节包括H2O2、GSH、炎症反应和脂肪酸β氧化等［18］。因此，促进肝细胞线粒体的能量代谢是寻找APAP肝毒性防治的策略之一。

3.3 传统中药防治APAP肝毒性作用

我国中医传统将柴胡、五味子、三七和丹参等中药广泛用于治疗肝病，可能具有防治药物肝毒性的功能。已有研究表明，柴胡能够调控炎症反应，柴胡提取物可以减轻APAP肝毒性的发生。柴胡皂苷d是柴胡的主要有效成分之一，能够对抗四氯化碳、二甲基亚硝胺引起的肝炎、肝癌和肝纤维化等毒性［43－44］。本课题组对中药单体柴胡皂苷d的研究发现，提前5 d给柴胡皂苷d 2 mg·kg－1能够防治APAP 200 mg·kg－1所导致的肝毒性，且该保护作用通过抑制IL-6-STAT3-SOCS3炎症反应通路产生。五味子是中国最常用的护肝传统中药之一，其提取物对APAP引起的肝损伤具有明显的保护作用，该保护作用与上调过氧化物酶体增殖物激活受体α的靶基因Cpt1和Acot1等、恢复脂肪酸β氧化至正常水平有关［45］。因此，从传统中药中筛选有效单体化合物，对防治APAP肝毒性具有巨大的潜力。

3.4 植物提取物防治APAP肝毒性作用

齐墩果酸(deanolic acid)是植物来源的三萜系化合物，它可防治小鼠APAP的肝毒性，但在核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)敲除小鼠(Nrf2－/－)中保护作用较弱，认为齐墩果酸促进Nrf2的核积聚，诱导Nrf2依赖的靶基因，从而有助于防治APAP的肝毒性［46］。组织病理学观察和生物化学检查提示，虾子花(Woodfordia fruticosa)的甲醇提取物有效地防治APAP引起的大鼠肝损伤，认为其保肝作用是通过抑制肝总蛋白消耗和恢复GSH水平发挥的［47］。金樱子(Rosa laevigate Michx)果中的总皂苷可通过抗氧化作用，诱导自吞噬，抑制炎症反应和细胞凋亡发挥对小鼠的保肝作用，并可能用于防治APAP肝损伤［48］。

在民间，普果拉灵呆明碱(Pergularia daemia)植物常被用于治疗肝病和黄疸。其水提取物和乙醇提取物预处理可显著减轻由APAP诱导的肝生化指标和组织病理变化，其作用与水飞蓟素相当，且乙醇提取物比水提取物有更好的保肝作用［49］。长叶獐牙菜(Swerchia lobgifolia Boiss)的地上部分总植物提取物和甲基獐牙菜口山酮(Swerchirin植物的主要成分)预处理可显著降低Swiss小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶等活性，表现出良好的抗 APAP肝损伤的作用［50］。然而上述提取物APAP肝毒性保护作用机制尚不清楚。

4 展望

APAP过量后，肝细胞损伤开始于APAP活性代谢物的产生和 GSH耗竭(0～30 min)，然后共价结合胞浆和线粒体的蛋白质(30～120 min)，引起线粒体功能障碍、活性氧和过氧化亚硝酸盐形成，从而导致线粒体膜孔开放和线粒体膜电位崩溃(2～6 h);线粒体功能障碍也导致核DNA断裂和溶解，这些事件都导致肝细胞肿胀坏死。APAP肝毒性的核心是细胞内事件导致肝细胞肿胀坏死，炎症反应可能通过支持细胞内活动或促进氧化应激加重细胞损伤，但炎症反应对去除细胞碎片和促进细胞再生也至关重要。

目前肝毒性药物防治已经有进展，所涉及的保护机制包括调节氧化应激、炎症反应、脂肪酸β氧化和APAP代谢排泄等。基于目前的认识，导致细胞肿胀坏死的信号转导机制可能存在大量的关联靶点，深入研究代谢活化和共价结合后的生化事件，加强对传统中药的开发，都将对APAP肝毒性的药物防治产生积极的推动作用。

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