大豆异黄酮对糖尿病模型大鼠肾组织nephrin蛋白表达的影响

李荣霏，曹春芽，谭艳辉，刘志华

(怀化医学高等专科学校药理学教研室，湖南怀化 418000)

糖尿病肾病(diabetics nephropathy，DN)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，也是导致终末肾病的主要原因之一。大豆异黄酮(soybean isoflavone，SI)是从大豆中分离出的活性成分，主要包括大豆黄素、染料木素、3种游离型苷元和9种葡萄糖苷，其结构和功能与雌激素相似，因此又称为植物雌激素。SI具有抗溶血、抗氧化、抗癌、降低血脂、预防骨质疏松、改善妇女更年期综合征等作用［1－2］。已有报道，SI可明显降低糖耐量异常大鼠的尿微量白蛋白水平，对糖尿病大鼠肾具有保护作用［3］。本研究通过制备实验性糖尿病大鼠模型，探讨SI对糖尿病大鼠肾的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

健康雄性SD大鼠购自南华大学动物实验中心，动物许可证号:SYXK(湘)2010－0006，体质量250～350 g，10周龄。饲养环境为每笼5只，温度(20～24)℃，相对湿度 53% ～57%。链佐星(streptozocin，STZ)购自美国 Sigma公司;SI(总异黄酮含量为96.8%，其中金雀异黄素为42%、大豆素38%)购自华北制药股份有限公司;兔抗大鼠nephrin多克隆抗体(一抗)和羊抗兔多克隆抗体(二抗)购自武汉博士德公司;肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)和 NF－κB 多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ELISA试剂盒购自上海博耀生物科技有限公司。AU400型全自动生化分析仪，日本Olympus公司;Lambda25型紫外分光光度计，美国Perkin Elmer公司;Coulter－L90 型超速离心机，美国Beckman公司;超声波细胞破碎仪，宁波新芝科器研究所;垂直电泳仪及转膜系统，美国 Bio－Rad公司。

1.2 糖尿病大鼠模型的制备

清洁级SD大鼠50只，适应性喂养1周，随机分为正常对照组(n=10)和糖尿病模型组(n=40)。糖尿病模型组禁食16 h后，按文献［4］一次性 ip 给予 STZ 60 mg·kg－1(STZ 溶于 0.1 mol·L－1柠檬酸缓冲液，pH为4.5)，正常对照组注射等体积柠檬酸缓冲液。72 h后随机测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。FBG ≥ 16.6 mmol·L－1为糖尿病模型制备成功大鼠。

1.3 动物分组和给药

将造模成功大鼠34只随机分为糖尿病模型对照组(n=8)及 SI 40，120 和 360 mg·kg－1组(n=8，9和9)。SI各给药组于造模成功次日起ig给予SI(SI临用时用0.5%羧甲纤维素钠配成混悬液)，每天 1次。糖尿病模型对照组和正常对照组ig给予等量生理盐水。所有大鼠在8周实验期间均自由饮水和摄取标准配方饲料，不使用胰岛素或降糖药，每周测1次血糖和体质量。

1.4 肾指数测定

每只大鼠取血后，摘取肾，去除被膜，用4℃预冷的生理盐水反复灌洗至颜色变苍白，滤纸吸干，称重。肾指数=肾质量(mg)/体质量(g)×100。

1.5 24 h尿蛋白检测

给药第8周末，每只大鼠分别放入代谢笼，正常饮水，禁食18 h后，收集 24 h尿液，离心保存于－70℃冰箱中，ELISA法检测24 h尿蛋白。

1.6 生化指标测定

给药第8周末，大鼠禁食12 h，测体质量。心脏采血，分离血清。全自动生化分析仪检测血肌酐(serum creatinine，SCr)，BUN和 MDA含量及SOD活性。

1.7 Western蛋白质印迹法检测肾组织nephrin，TNF－α和NF－κB蛋白表达

取100 mg肾组织加1 mL裂解液，于冰浴中超声破碎匀浆，4℃ 12 000×g离心20 min，取上清液，BCA法进行蛋白质定量，上样后进行 SDSPAGE电泳，转膜封闭后，与一抗4℃孵育过夜，再与二抗室温孵育1 h，显影后扫描，测定各条带积分吸光度(integrated absorbance，IA)。蛋白表达水平用待测蛋白条带与内参β肌动蛋白条带IA比值表示。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 SI对糖尿病模型大鼠FBG和肾指数的影响

造模成功后，糖尿病模型大鼠多饮，多食，多尿，体质量减轻，精神萎靡。给予SI 4和5周后，与模型对照组相比，SI显著降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)，尤其SI 120 和360 mg·kg－1作用更加明显(表1)。给药8周末，除正常对照组外，其余各组大鼠均有死亡，模型对照组和SI 40，120 及360 mg·kg－1组各死亡2，1，4和1只。SI 120 和360 mg·kg－1还可显著降低糖尿病模型大鼠肾指数(P ＜0.01)，360 mg·kg－1作用更明显(P＜0.05)(表2)。

Tab.2 Effect of SI on body mass and kidney indexes of diabetic model rats

2.2 SI对糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白、血清SCr及BUN水平的影响

与正常对照组比较，糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白明显升高(P ＜0.05);SI干预后，360 mg·kg－1组24 h尿蛋白水平明显降低(P＜0.01)。糖尿病模型对照组大鼠BUN和SCr水平与正常对照组比较明显升高(P ＜0.01);给予 SI 120 和360 mg·kg－1干预后，糖尿病模型大鼠BUN和SCr显著降低(P ＜0.01)，360 mg·kg－1作用更加明显(P ＜0.05，P ＜0.01)(表3)。

Tab.3 Effect of SI on levels of 24 h urine protein(UP)，blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(SCr)of diabetic model rats

2.3 SI对糖尿病模型大鼠SOD和MDA的影响

与正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠SOD活性显著下降，而MDA水平明显增加(P＜0.01);经 SI 120 和 360 mg·kg－1干预后，SOD 活性增加，MDA活性明显下降(P＜0.01)，360 mg·kg－1作用更加明显(P ＜0.01)(表4)。

Tab.4 Effect of SI on levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)of diabetic model rats

2.4 SI对糖尿病模型大鼠肾组织nephrin，TNF－α及NF－κB蛋白表达的影响

模型对照组nephrin水平明显低于正常对照组(P ＜0.01)，SI不同剂量组大鼠组织nephrin水平明显高于模型对照组(P ＜0.01)，SI 360 mg·kg－1时作用最显著(P＜0.01)。模型对照组TNF－α蛋白表达显著高于正常对照组(P＜0.01)，NF－κB表达无明显变化;经SI干预后，TNF－α 和 NF－κB 表达较模型对照组均显著降低(P＜0.01)，SI 360 mg·kg－1时作用更加明显(P ＜0.01)(图1)。

Fig.1 Effect of SI on expression of nephrin(A)，tumor necrosis factor－α(TNF－α)(B)and NF－κB(C)protein in renal tissue of diabetic model rats by Western blotting.See Tab.1 for the rat treatment.D was the semiquantitative result of A，B and C.±s，n=5－10.1:normal control group;2:model group;3－5:SI 40，120 and 360 mg·kg－1groups，respectively.＊＊P ＜0.01，compared with normal control group;##P ＜0.01，compared with model group;△△P ＜0.01，compared with SI 40 mg·kg－1group;▲▲P ＜0.01，compared with SI 120 mg·kg－1group.

3 讨论

DN是糖尿病全身微血管病变的肾表现，早期临床表现为尿微量白蛋白增加，随着DN的发展，蛋白尿的大量漏出可进一步促进肾小球硬化。导致蛋白尿发生的根本原因是足细胞裂孔膜蛋白损伤或表达下降引起足细胞的结构和功能障碍。nephrin蛋白特异性表达于足细胞裂孔膜，是组成裂孔膜的主要成分。Toyoda等［5］利用原位杂交的方法检测到糖尿病肾病患者足细胞nephrin mRNA表达明显减少，且与糖尿病肾病蛋白尿的进展呈负相关。已有研究证实，经STZ诱导的实验性糖尿病小鼠肾组织nephrin mRNA表达减少，而上调nephrin蛋白表达及nephrin mRNA水平，可减轻肾足细胞足突和基底膜损伤，24 h尿蛋白排泄量也明显减少，肾功能得到改善［6］。

本研究通过给予STZ建立糖尿病大鼠模型，经SI干预，结果显示，SI为 120 mg·kg－1时糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白水平显著降低;给予SI 4～5周后，糖尿病模型大鼠血糖降低，部分大鼠死亡，可能是由于低血糖所致。同时还发现，SI可使nephrin蛋白表达上调，且360 mg·kg－1时作用最显著，提示SI可能部分通过恢复nephrin蛋白表达，维持足细胞结构完整，减少糖尿病模型大鼠尿蛋白排泄，发挥肾保护作用。

多种因素可引起糖尿病肾足细胞损伤，导致nephrin表达降低。体外研究发现，巨噬细胞及其分泌的炎症因子可降低nephrin基因启动子的活性及蛋白表达［7］。也有研究证实，氧化应激与nephrin表达下降呈明显相关［8］。而炎症反应、氧化应激产生的活性氧族等均可以激活 NF－κB。NF－κB是介导细胞内信号转导的转录因子，在机体的免疫应答、炎症反应和细胞凋亡调控等方面发挥重要作用。NF－κB可启动其下游基因的转录，导致包括TNF－α在内的一系列炎症因子的过度表达［9］。同时TNF－α又是NF－κB的重要诱导因子，参与构成NF－κB 的正反馈环，两者在肾小球疾病向纤维化方向发展产生协同作用。本研究结果表明，糖尿病模型大鼠出现高血糖，体质量减轻，尿蛋白增加，同时nephrin蛋白表达降低，SOD活性降低，MDA含量增高，提示糖尿病模型早期出现足细胞损伤，肾组织抗氧化能力下降。SI干预后，尿蛋白减少，nephrin表达增多，提示SI对糖尿病模型大鼠肾损伤有一定的保护作用。同时SI减少MDA生成，抑制SOD损失，抑制TNF－α及NF－κB的表达，提示SI对糖尿病模型大鼠肾的保护作用可能与降低NF－κB和TNF－α表达、发挥抗炎和抗氧化应激作用有关。

［1］Zhang JD，Zhang TD，Tao RQ，Yang SW.Effect of soy isoflavones on the bone mineral density and the expression of estrogen receptor alpha in osteoblasts of ovariectomized rats［J］.Chin J Tissue Eng Res(中国组织工程研究)，2012，16(42):7804－7808.

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［5］Toyoda M， Suzuki D， Umezono T， Uehara G，Maruyama M，Honma M，et al.Expression of human nephrin mRNA in diabetic nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，2004，19(2):380－385.

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