氯沙坦对百草枯急性染毒大鼠肺组织氧化损伤的影响

郭 芳，孙应彪，李 盛，苏 莉，刘志飞，赵 迟

(1.兰州大学公共卫生学院，甘肃兰州 730000;2.兰州市疾病预防控制中心，甘肃兰州 730030)

百草枯(paraquat，PQ)属有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂，对人畜均有较强毒性，因缺乏特效解毒剂及有效降低毒物毒性的治疗手段，PQ急性中毒是临床常见除草剂急性中毒之一，病死率高达50% ～80%［1］。氧化应激是目前公认的 PQ中毒机制。研究发现，NF－κB作为一个氧化应激敏感型转录因子可被PQ中毒后产生的大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活，使机体处于氧化应激状态，活化后的NF－κB还可进一步引起炎症反应和肺组织纤维化的发生［2］。

肾素－血管紧张素(angiotensin，Ang)系统广泛存在于肾、心、肺和肝等组织，能够独自合成AngⅡ，AngⅡ是机体组织纤维化调节器，能够通过AngⅡ1型受体(AngⅡ type 1 receptor，AT1R)的激活诱导肺成纤维细胞的扩散和肺间质胶原蛋白沉积［3－4］。在正常大鼠肺组织中，存在大量 AT1R［5］，AngⅡ与AT1R结合可引起肺成纤维细胞的扩散进而引起肺部严重损伤和肺纤维化。氯沙坦作为AT1R拮抗剂，可保护由高氧引起的小鼠肺损伤并抑制肺部纤维化的发生［6］。本研究通过建立PQ急性肺损伤大鼠模型，观察氯沙坦对PQ所致肺组织形态、氧化应激和NF－κB基因表达水平异常变化的干预作用，为临床PQ急性中毒治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SPF级成年雄性SD大鼠32只，体质量180～220 g，甘肃省中医学院实验动物中心，动物合格证号 SCXK［甘］2011－0001－0001011。

1.2 试剂和仪器

PQ，美国Sigma公司;氯沙坦钾片，杭州默沙东制药有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T－AOC)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;Trizol试剂，美国Life Technology公司;NF－κB和β肌动蛋白引物(表1)，上海捷瑞生物工程有限公司;逆转录和实时荧光定量PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。Eon全功能多波段酶标仪，美国BioTek公司;722型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;BX53光学显微镜，日本Olympus公司;SmartSpec Plus核酸蛋白测定仪和 CFX96 Real－Time System，美国 Bio－Rad 公司;Microfuge22R型低温离心机，美国Beckman公司;TC－512型普通PCR仪，北京瑞尔欣德科技有限公司。

Tab.1 Primer sequences and theoretical amplification lengths

1.3 动物分组和处理

选择32只健康成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组、PQ染毒组以及氯沙坦干预7 d(PQ+氯沙坦7 d)和14 d(PQ+氯沙坦14 d)组。正常对照组大鼠每天ig给予生理盐水10 mL·kg－1，连续15 d。PQ染毒组一次性 ig PQ 40 mg·kg－1染毒，此后每天等容积ig给予生理盐水至第15天。氯沙坦干预7和14 d组于一次性ig给予PQ 40 mg·kg－1染毒后次日，根据临床成人每天用药等效剂量ig给予氯沙坦10 mg·kg－1，每天1次，连续7和14 d。

1.4 肺组织病理变化观察

各组大鼠于给药第16天采用颈椎脱位法处死，取右肺中叶用4%多聚甲醛固定，常规制备石蜡切片并行HE染色，观察肺组织病理学改变，以确定急性肺损伤造模是否成功。光学显微镜观察肺组织病理组织学变化。剩余肺组织用无菌生理盐水漂洗后液氮中冻存，用于其他指标检测。

1.5 肺组织匀浆中 T－SOD，CAT，LPO和 T－AOC水平测定

准确称取左侧肺组织，按质量(g):体积(mL)=1∶9的比例加入无菌生理盐水，冰水浴匀浆，1000×g离心10 min，取上清液BCA法检测蛋白质浓度，并根据试剂盒操作步骤检测各项指标，结果用单位质量蛋白质中各指标含量表示。

1.6 大鼠肺组织NF－κB mRNA表达水平检测

取液氮中保存的肺组织约100 mg加入1 mL Trizol于冰浴中匀浆并提取总RNA，用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度并确保其A260nm/A280nm在1.8～2.2之间。根据 RNA逆转录试剂盒说明书，选择10 μL反应体系，于 37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃5 min将 RNA逆转录为 cDNA，－20℃保存。以cDNA为模板，用 NF－κB引物进行实时荧光定量PCR扩增，内参照为β肌动蛋白。实时荧光定量PCR反应过程严格按照SYBR Premix Ex TapⅡ试剂盒说明书进行。反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。所有样品均采用相同的阈值得到Ct值并采用Pfaffl法［7］计算NF－κB mRNA的相对表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 氯沙坦干预后大鼠肺组织病理改变

如图1所示，正常对照组肺泡间隔及肺泡腔大小如常，肺泡间隔内未见明显胶原沉积及炎性细胞浸润，间质小血管管壁如常(图1A)。PQ染毒组肺泡间隔弥漫性显著增宽，肺泡腔狭窄或闭合，肺泡间隔及肺间质内大量胶原沉积，成纤维细胞增生，部分区域可见炎性细胞浸润，间质小血管壁增厚，管腔狭窄(图1B)。氯沙坦7 d干预组肺损伤比PQ组减轻，肺间质胶原沉积减少，但多数区域肺间质内仍有成纤维细胞增生，间质小血管管壁仍增厚(图1C)。氯沙坦14 d干预组肺组织多数区域接近正常，肺间质胶原沉积进一步减少，间质小血管管壁轻微增厚(图1D)。

Fig.1 Effect of losartan on paraquat(PQ)induced histopathological changes of lung tissuein rats(HE ×200).The rats were ig given losartan 10 mg·kg －1for 7 and 14 d after being single ig given PQ 40 mg·kg －1.A:normal control group;B:PQ group;C － D:losartan intervention for 7 and 14 d groups，respectively.The arrows show lung interstitial capillary.

Tab.2 Effect of losartan on oxidative stress change in lung tissues of rats induced by PQ

2.2 氯沙坦干预后大鼠肺组织氧化应激水平的变化

由表2可见，与正常对照组比较，PQ染毒后大鼠肺组织中T－SOD和CAT活性明显降低，T－AOC明显减弱，LPO 含量明显升高(P ＜0.05，P ＜0.01)。与PQ染毒组比较，氯沙坦干预7 d大鼠肺组织中T－SOD和CAT活性明显回升(P＜0.05，P＜0.01)，T－AOC活性和LPO含量无明显变化;氯沙坦干预14 d T－SOD和CAT活性及T－AOC均明显升高，LPO 含量明显降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，均恢复接近正常水平。提示氯沙坦对PQ急性染毒大鼠肺组织中 T－SOD，CAT，T－AOC 和 LPO 活性或含量的异常变化具有逆转作用。

2.3 氯沙坦干预后大鼠肺组织NF－κB mRNA表达水平的变化

由图2可见，与正常对照组比较，PQ组大鼠肺组织中 NF－κB mRNA表达水平明显升高(P＜0.05)。与PQ染毒组比较，氯沙坦干预7和14 d大鼠肺组织中 NF－κB mRNA含量明显下降(P＜0.05)，基本恢复接近正常水平。

Fig.2 Effect of losartan on NF－κB mRNA expression induced by PQ in lung tissue of rats by real－time quantitative PCR.See Fig.1 for the rat treatment.The NK－κB mRNA expression was analyzed by Pfaffl method.±s，n=8.*P ＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with PQ group.

3 讨论

据报道，肺泡上皮细胞和气管Clara细胞借助多胺摄取途径将PQ转运入肺并产生大量ROS，导致机体处于氧化应激状态，进而引发链式脂质过氧化反应，使细胞膜受体、膜蛋白酶和离子通道脂质的微环境发生改变，引起肺组织氧化性损伤［8］。正常情况下机体内存在着消除自由基的防御体系，其中SOD和CAT活性直接反映机体清除ROS的能力［9］。据报道，PQ进入人体内后经由NADPH辅助的单电子还原为自由基，该自由基能与氧反应形成超氧阴离子，后者能诱导产生更多的ROS如过氧化氢、羟自由基等，间接使体内SOD活力降低，并诱导产生更多的LPO，最终引起肺泡间质不可逆的纤维化［10－11］。本研究结果表明，PQ染毒组肺组织中SOD和CAT活性明显降低，T－AOC明显减弱，而LPO含量明显升高，提示PQ中毒早期氧化应激损害占有重要地位。

NF－κB属于对氧化还原敏感的Rel蛋白家族。因此，ROS的释放和氧化还原状态的改变可直接激活 NF－κB［12］。被活化的 NF－κB 引起细胞因子网络调控失衡，大量炎性因子的产生导致肺部炎症的发生并最终引起肺纤维化［2］。本研究结果表明，PQ染毒后大鼠肺组织病理改变主要表现为肺泡间隔显著增宽，肺泡腔狭窄或闭合，部分区域可见炎性细胞浸润和胶原蛋白沉积;同时肺组织NF－κB mRNA明显上调。提示NF－κB参与了PQ急性肺损伤过程。

氯沙坦是常见的AT1R拮抗剂，可选择性地作用于AT1R，以阻断内源性和外源性的AngⅡ所产生的各种生理反应。在脂多糖诱导的大鼠肺损伤模型中，氯沙坦干预可显著抑制AT1R和NF－κB活性［13］。此外，氯沙坦可通过抗自由基和阻断AngⅡ的促炎反应治疗平阳霉素引起的大鼠肺损伤［14］。本研究结果表明，随着氯沙坦干预时间的延长，PQ染毒组大鼠肺组织中SOD和CAT活性及T－AOC明显增强，LPO含量明显降低，NF－κB mRNA表达明显降低。肺组织病理观察结果表明，氯沙坦干预14 d肺组织大多数区域未见明显病变，并接近于正常水平。

综上所述，氯沙坦通过增强肺组织的抗氧化能力和降低NF－κB mRNA表达而减轻PQ所致的急性肺损伤，为临床综合治疗PQ急性中毒提供新的思路。

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