MicroRNAs在支气管哮喘中的研究进展①

卞勇华 崔玉宝(盐城卫生职业技术学院医学检验学院，盐城 224005)

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的，以气道炎症、气道高反应性(Airway hyper responsiveness，AHR)、可逆性气道阻塞为特征的气道慢性炎症性疾病。据估计全球约有3亿哮喘患者，每年有25万人死于哮喘病［1］。气道炎症是哮喘最主要的病理变化，以肥大细胞、中性粒细胞、Th2细胞及嗜酸性粒细胞的浸润为主要特征，并决定气道阻塞和AHR的程度。Th2细胞分泌的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)与气道炎症密切相关，并可以促进IgE的产生、嗜酸性粒细胞的增殖和分化、黏液的分泌，诱导气道高反应性和气道重塑［2，3］。气道重塑被认为是哮喘难治的根本原因，近年来受到了研究者的高度重视，但是目前尚缺乏有效的防治措施。

目前对于哮喘主要是应用糖皮质激素(如地塞米松)和β-2受体激动剂(如沙丁胺醇、沙美特罗等)进行治疗。虽然这些药物通过控制气道炎症和舒张气道平滑肌(Airway smooth muscle，ASM)极大改善了哮喘患者的症状，但是副作用明显，如发音困难、鹅口疮和心律失常等［4］。此外，还有相当一部分哮喘患者对糖皮质激素并不敏感。因此，急需寻找一种新的、有效的、副作用少的方法来治疗哮喘。

MicroRNAs(miRNAs)是一种长度约为22个核苷酸(nucleotide，nt)的内源性非编码单链小分子RNA，通过对靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，负调控靶基因的表达。miRNAs在癌症、病毒感染、肺部炎症性疾病均发挥了重要的功能［6-8］。本文就近年来miRNAs在哮喘发病中的作用及潜在的应用前景作一综述。

1miRNAs概述

随着1993年第一个miRNA(lin-4)在线虫中被发现，越来越多的miRNAs在不同物种被发现，截止到2013年6月miRBase 20(www.mirbase.org)显示:已注册miRNAs含有发夹结构 miRNAs前体序列24 521个，成熟miRNAs序列30 424个。大量研究表明，miRNAs广泛参与细胞增殖、分化及凋亡、应激反应、免疫反应等多种生物活动过程［9，11］。miRNAs由大小为60～75个 nt具有茎环结构的miRNAs前体(pre-miRNAs)剪切生成，成熟的miRNAs在细胞质中与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，形成miRNAs沉默复合体。miRNAs沉默复合体通过miRNAs 5'端6～8个 nt的种子序列互补结合靶mRNA的3'端的非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)阻断核糖体读取mRNA或者直接降解mRNA，调控靶 mRNA 的表达［5］。

miRNAs代表一类新的药物靶标，可以通过反义抑制或过表达miRNAs治疗相应疾病［12］。反义抑制miRNAs方法包括使用2'-OMe或锁核苷酸(Locked nucleic acid，LNA)修饰的反义寡聚核苷酸(Anti-miRs)和胆固醇分子偶联的寡聚核苷酸(Antago-miRs) 结合miRNAs使其失活［13，14］。miRNAs表达下调所引起的疾病可以使用miRNA类似物或成熟的miRNAs进行替代治疗。表达短发夹RNAs的质粒或病毒载体可用于miRNAs的过表达和稳定表达，因为这种方法可以方便地通过一个转录物表达多个 miRNAs［15］。通过这些方法调节miRNAs功能为哮喘的治疗提供一种新的思路。

2miRNAs与哮喘

虽然目前对于miRNAs与哮喘关系的研究相对较少，但现有研究表明miRNAs与哮喘的疾病进程密切相关。例如，Garbacki等［16］对急性、亚急性和慢性小鼠哮喘模型的肺组织miRNAs表达谱分析发现8个可能与哮喘相关的候选miRNAs。Tsitsiou等［17］对哮喘患者miRNAs表达谱分析证实，重度哮喘患者 CD8+和CD4+T细胞中miR-28-5p和 miR-146a/b表达选择性下调与mRNA表达的广泛变化相关。

2.1 miRNAs与细胞因子及炎症

2.1.1 miR-126 通过对小鼠哮喘模型的研究，Mattes等［18］报道尘螨(House dust mite，HDM)诱导的小鼠急性哮喘模型气道中miR-126的表达显著上调，而通过antago-miR-126抑制其表达可缓解哮喘特征性反应如气道炎症和气道高反应性、Th2型细胞因子(如IL-5和 IL-13)分泌、气道嗜酸性粒细胞浸润和黏液分泌。miR-126的表达上调依赖于TLR4/MyD88信号通路，因为HDM诱导的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)或髓样分化因子88(Myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)缺陷小鼠均未出现miR-126的表达上调，并且AHR降低和气道嗜酸性粒细胞浸润减少。然而，Collison等［19］发现在卵白蛋白(Ovalbumin ，OVA)诱导的小鼠慢性哮喘模型中miR-126在诱导的最初2周表达上调，6周后下降至基线水平附近。通过antago-miR-126抑制miR-126的表达，只能减少小鼠慢性哮喘模型气道嗜酸性粒细胞浸润，而对气道慢性炎症和气道重塑不产生影响，提示可能有多种miRNAs参与了哮喘发生的调控。

2.1.2 Let-7 Let-7家族是miRNAs中研究最为深入的家族之一，其家族成员在不同的物种高度保守。人类let-7家族有11个成员(let-7a-g、let-7i-k、mir-202)，其中 let-7j和 let-7k 在小鼠是不表达的［20］。IL-13与哮喘的发病密切相关，可引起气道反应性增高、嗜酸粒细胞浸润和黏液分泌增多［21］。Polikepahad等［22］通过荧光素酶报告系统证实IL-13是let-7a的直接作用靶点，进一步研究发现反义抑制let-7a可提高小鼠CD4+T细胞中IL-13 mRNA的表达水平，推测let-7a可能是哮喘的抗炎因子。然而体内实验证实，抑制OVA诱导的小鼠哮喘模型中let-7a-d表达可减少哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(Broncho alveolar lavage fluid，BALF)中炎症细胞浸润，降低Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)表达水平，提示let-7在哮喘发生过程中具有促炎作用［22］。但是，Kumar等［23］研究结果却与此相反，他们的研究证实let-7哮喘发生过程中具有抗炎作用，可直接抑制IL-13的表达，并且在OVA诱导的小鼠哮喘模型肺组织中let-7家族成员(let-7a-d、let-7f-g、let-7i)表达下调。鼻腔给予let-7类似物，可以缓解OVA诱导的小鼠哮喘模型气道炎症、降低AHR、减少气道黏液分泌和纤维化。因此，Let-7在哮喘发生过程中的功能还需要进一步研究证实。

2.1.3 miR-21 Lu等［24］第一次证实 miR-21在哮喘发生过程中具有重要功能，在OVA、烟曲霉菌、IL-13转基因诱导的小鼠哮喘模型中均观察到miR-21表达上调。进一步研究发现miR-21通过调控靶基因 IL-12p35抑制IL-12的表达。IL-12对维持Th1/Th2平衡起重要作用［25］，IL-12的表达降低部分解释了哮喘过高的Th2免疫应答。Lu等［26］通过miR-21-/-基因敲除小鼠进一步研究 miR-21的功能，发现OVA诱导的 miR-21-/-基因敲除小鼠哮喘模型肺部嗜酸性粒细胞的浸润较少，BALF中IFNγ和IL-12表达水平升高，IL-4的表达水平显著降低。这些结果表明miR-21对Th1/Th2的平衡调节起重要作用。此外，也有研究报道miR-21可负反馈调控程序性细胞死亡因子4(Programmed cell death 4，PDCD4)的表达从而发挥抗炎作用［27］。miR-21的这种双重作用表明miRNAs调控的复杂性，这两项研究表明miR-21是重要的免疫调节分子。

2.1.4 miR-155 miR-155已经被证实在Th1/Th2分化过程中起关键作用。Banerjee等［28］研究发现过表达miR-155可促使CD4+T细胞分化为Th1细胞，而抑制miR-155的表达可促使CD4+T细胞分化为Th2细胞。Martinez-Nunez等［29］报道 miR-155可通过调控IL-13通路影响巨噬细胞的表型，从而使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。Th1/Th2细胞之间的比例和功能失衡是哮喘的主要发病机制之一，这些研究结果表明miR-155与哮喘的发生密切相关。Zhang等［30］在哮喘患者外周血CD4+T细胞中观察到miR-155的表达下调，其表达水平与哮喘严重程度相关，提示miR-155在哮喘发生过程中具有重要作用。因此，增加miR-155的表达可能是减缓哮喘发病和治疗的一条新途径。

2.1.5 miR-145 虽然对哮喘发生过程中miR-145的作用研究还不充分，但 Collison等［31］发现其在HDM诱导的哮喘小鼠模型气道壁中表达上调。Collison等［31］进一步研究发现在第一次HDM诱导前鼻内给予anti-miR-145，可明显减少气道黏液分泌、嗜酸性粒细胞浸润，降低气道高反应性和Th2型细胞因子(IL-5、IL-13)的表达水平，与地塞米松的抗炎作用相当。而在最后一次HDM诱导前鼻内给予anti-miR-145，只能减少气道黏液分泌和降低气道高反应性，对嗜酸性粒细胞浸润不起作用。这些结果表明miR-145在哮喘发生过程中具有促炎作用，其具体作用机制还有待深入研究阐明。

2.1.6 miR-146 miR-146家族包括miR-146a和miR-146b，哮喘患者 miR-146a和 miR-146b表达水平的改变已经被报道。Tsitsiou等［17］发现重度哮喘患者体内 CD4+和 CD8+T细胞 miR-146a和 miR-146b的表达下调。miR-146a的表达下调可能与重度哮喘的发生有关，因为有报道证实在急性和慢性炎症发生过程中miR-146a敲除的T细胞活性增强［32］。但是，也有研究报道在OVA诱导的小鼠哮喘模型中脾CD4+T细胞miR-146a和miR-146b的表达上调，是哮喘的促炎因子［33］，所以，miR-146a和miR-146b在哮喘发生过程中的作用还需要进一步研究。

2.1.7 miR-106a miR-106a已经被证实可以通过转录后调控抑制IL-10的表达［34］。IL-10是目前已知具有抗炎作用的细胞因子，研究表明利用携带IL-10基因的重组腺病毒治疗OVA诱导的小鼠哮喘模型，可明显减轻哮喘小鼠的AHR和气道炎症［35］。Sharma等［36］报道在OVA诱导的小鼠哮喘模型肺部miR-106a的表达显著上调，而IL-10的表达显著下调。利用 anti-miR-106a抑制小鼠哮喘模型肺部miR-106a的表达，发现哮喘小鼠肺组织中IL-10的表达增加，AHR和气道炎症明显缓解，Th2免疫应答、杯状细胞化生以及气道纤维化明显减少。作者声称，这项工作是第一次在体内证明了miRNAs对IL-10表达的调控作用，为预防哮喘发生提供了一个新的思路。

2.1.8 miR-221 Mayoral等［37］报道 miR-221 对活化的肥大细胞具有特异性作用，可以调节肥大细胞的脱颗粒、细胞因子释放、迁移和黏附。肥大细胞是参与Ⅰ型超敏反应的主要效应细胞，提示miR-221可能与Ⅰ型超敏反应疾病(如哮喘、过敏性鼻炎)的发生密切相关。Liu等［38］发现miR-221可能在哮喘发生过程中具有重要的功能，通过miRNAs微阵列分析和定量PCR发现儿童哮喘患者及OVA诱导的小鼠哮喘模型中miRNA-221和miRNA-485-3p的表达上调。Qin等［39］证实在OVA诱导的小鼠哮喘模型中miR-221表达上调，抑制miR-221的表达可减轻小鼠哮喘模型的气道炎症。

2.2 miRNAs与气道平滑肌

2.2.1 miR-133a与高反应性 Chiba等［40］第一次提出miR-133a可能在哮喘中具有重要功能的假说。假说源于miR-133a对心脏肌肉收缩影响的一项研究，推测 miR-133a对于支气管平滑肌(Bronchial smooth muscle，BSM)可能有类似的作用。实验证实miR-133a可负反馈调节 ASM细胞中 RhoA(Ras homolog gene family member A)的表达，在IL-13刺激人BSM细胞和OVA诱导的小鼠哮喘模型中miR-133a表达下调，RhoA表达上调。RhoA是BSM收缩的一个关键蛋白，其表达上调可促进BSM的收缩，增强 ASM 高反应性［41］。Kume 等［42］研究表明RhoA/Rho激酶信号通路可能是治疗哮喘患者气道高反应性的新靶点，通过上调BSM细胞中miR-133a的表达水平抑制RhoA/Rho激酶信号通路可能会缓解哮喘患者气道的高反应性，当然这需要进行深入研究。

2.2.2 miR-25与表型改变 虽然平滑肌的高反应性是研究热点，但平滑肌表型的改变也促进了平滑肌高反应性和炎症介质的产生。Kuhn等［43］研究了miRNAs在ASM表型改变中的作用。他们利用IL-1β、TNF-α 和 IFN-γ 混合物模拟炎症刺激，通过miRNAs微阵列分析和定量PCR发现在炎症刺激的ASM细胞中miR-25表达显著下调。利用生物信息学方法预测靶基因及实验证实miR-25可以通过调节炎症介质(RANTES，嗜酸粒细胞趋化因子等)和调控细胞外基质转化相关基因及肌球蛋白重链等收缩蛋白的表达，共同影响ASM表型。但是，miR-25是通过对哪些靶基因转录后调控来影响ASM表型，还有待进一步研究阐明。

2.3 miRNAs与哮喘遗传因素 HLA-G(Human leukocyte antigen，HLA)是已经被证实的哮喘易感基因［44］，属于HLAⅠ类基因，其编码的HLA-G分子主要存在于母胎界面，有助于母胎免疫耐受的产生。Tan等［45］研究发现 HLA-G的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)与哮喘易感性相关，并且可以影响miRNAs对HLA-G的调控。HLA-G SNP位点(+3142C/G)位于miR-152家族(miR-148a、miR-148b、miR-152)与 HLA-G 结合的靶点。HLA-G+3142G/G基因型与miR-152家族的结合较+3142C/C基因型结合稳定，提示SNP位点(+3142C/G)有可能是通过干扰miR-152家族与HLA-G的结合，从而影响miR-152家族对HLA-G的调控。Nicodemus-Johnson等［46］研究发现母亲是否患有哮喘将影响哮喘患者miR-148b和可溶性HLAG分子(sHLA-G)的表达。母亲患有哮喘的患者气道上皮细胞中miR-148b的表达显著下调，BALF中sHLA-G分子浓度与SNP位点(+3142C/G)基因型密切相关。这提示miR-152家族对HLA-G的调控不仅与哮喘患者的HLA-G基因型有关，而且还与其母亲是否患有哮喘相关。

Su 等［47］进行了pre-miRNAs的SNPs研究，在其前期工作基础上选择了4个SNPs位点(rs11614913、rs3746444、rs2910164、rs2292832)，其中rs2910164位点C等位基因和rs2292832位点T等位基因的出现可降低中国人患哮喘的风险。Jimenez-Morales等［48］也发现了类似的结果，墨西哥女性哮喘患者rs2910164位点C等位基因的出现伴随着哮喘发病风险的降低。rs2910164位点存在于miR-146a的pre-miRNAs的茎环结构中，其多态性可能影响 pre-miR-146a加工或者 miR-146a的功能［49］。而miR-146a可通过调节白介素1受体相关激酶 1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor，TRAF6)表达负反馈调节TLR4通路，在哮喘气道炎症及气道重塑过程中具有重要的作用［50］。

3 结语

虽然miRNAs在哮喘发病机制中的研究仍处于起步阶段，但是一些miRNAs已经被证实对哮喘的发病起促进或抑制作用，有可能作为未来哮喘治疗的靶点。基于Let-7和miR-146类似物的药物有可能显著纠正哮喘患者肺部IL-13的过表达及其他促炎细胞因子的表达，而基于miR-133a类似物的药物可能修复ASM细胞的高反应性。相反，利用antimiRs抑制 miRNAs(miR-21、miR-106a、miR-126、miR-145、miR-155、miR-221)的表达，有可能控制哮喘患者肺部细胞因子的异常表达和炎症的发生。选择有效和特异性的miRNAs/anti-miRs，令其有效地进入呼吸道及到达预定位置后缓慢释放都是基于miRNAs哮喘药物的进一步研究方向。

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