Rho激酶与疼痛及其抑制剂的临床应用

张雪琼，张永鹤

Rho是一种小分子G蛋白，RhoGTP蛋白存在GDP、GTP两种结合形式，在失活与激活状态之间转化而扮演着“分子开关”的角色。Rho激酶（Rho-associated coiled-coil-forming kinases，ROCK）是Rho的主要效应底物，含有两种异构体ROCK1及 ROCK2，属于丝／苏氨酸蛋白激酶［1］。研究表明［2－3］，Rho／ROCK对细胞的收缩、迁移、增殖、黏附和凋亡等活动具有重要的调控作用。Rho／ROCK通过与血管紧张素Ⅱ、内皮素-1等血管活性物质相互作用，使肌球蛋白轻链磷酸酶失活，从而导致血管痉挛。

针对Rho／ROCK信号通路抑制剂的药物研发策略，主要集中在防治高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死和心力衰竭等心脑血管疾病。本文将通过阐述Rho／ROCK信号通路在疼痛的产生和持续过程中的作用及其抑制剂在临床研究中的使用案例，探讨Rho／ROCK作为镇痛药物作用靶点的可能性。

1 Rho／ROCK与疼痛

大量研究表明［4］，Rho／ROCK可促进炎性因子分泌，参与炎性因子损害，促进细胞凋亡，使神经突触崩解等过程，在神经性疼痛、炎症性疼痛、糖尿病性周围神经疼痛、脑血管痉挛、血管痉挛性心绞痛及骨癌痛等多种疼痛的产生和持续过程中起重要作用。

1.1 Rho激酶与神经性疼痛、炎症性疼痛 神经病理性疼痛综合症由神经系统损伤或相关疾病引起。在中枢神经系统各种功能出现障碍时，Rho／ROCK信号通路被异常激活。损伤成年脊椎动物的大脑和脊椎可激活ROCKs，从而抑制神经突触的发育；抑制ROCKs可促进哺乳动物脊椎损伤后的神经再生和功能恢复；阻断Rho／ROCK信号通路在脑卒中、炎症、脱髓鞘病、阿尔采末病和神经性疼痛等多种动物模型上显示有益的治疗作用［4］。

周围神经系统（包括神经元、神经、背根神经节、后根）和中枢神经系统（丘脑、脊髓）损伤均可引起神经性疼痛，其特点是机械性痛觉超敏和热痛觉过敏，目前尚无有效的治疗方法。研究表明，炎性介质溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）在神经性疼痛的启动过程中起关键作用。动物实验表明，LPA通过激活RhoA／ROCK通路，启动外周神经损伤引起的神经性疼痛。抑制Rho／ROCK通路，可阻断LPA诱发的神经疼痛症状［5］。脊神经根切断术1周后，鞘内注射ROCK抑制剂Y-27632不仅能够降低冷痛觉过敏，还能诱发单胺能神经可塑性，提示，阻断Rho／ROCK通路能够增强神经突触可塑性，并能减轻脊神经根切断术后的疼痛［6］。

三叉神经痛是一种严重的慢性疼痛综合征。其主要症状是强烈的刺状痛或电休克样阵痛。研究发现，采用1 nmol·L－1LPA注射至大鼠三叉神经节内诱导的三叉神经根脱髓鞘改变模型，预先给予 LPA1／3受体拮抗剂 DGPP和ROCK抑制剂Y-27632时，DGPP能拮抗机械性痛觉超敏和对损伤侧痛觉的过度敏感反应，而Y-27632能对抗同侧和对侧的机械性痛觉的过度敏感反应。这些研究结果提示，拮抗LPA受体和抑制ROCK通路可能是一种脱髓鞘改变诱导的三叉神经痛样伤害感受的重要治疗方法［7］。

豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C的底物（myristoylated alamine-rich C-kinase substrate，MARCKS）作为脑内蛋白激酶C的重要底物，参与突触运输和神经递质释放，与炎性疼痛的形成和神经痛的维持密切相关。ROCK能使MARCKS的Ser159磷酸化，从而产生和维持神经病理性疼痛。动物实验结果显示，椎管内直接给予ROCK抑制剂可缓解福尔马林诱导的炎性疼痛及选择性L5脊神经切断引起的神经性疼痛［8］。

在右侧膝关节上注射Monoiodoacetate制备的大鼠关节炎模型中，发现ROCK1和ROCK2 mRNA水平明显升高，连续3周注射ROCK选择性抑制剂AS1892802至对侧膝关节或口服给药，能明显减轻关节炎表面的磨损伤害。在体外实验中，该抑制剂能够诱导软骨细胞分化，并抑制滑膜细胞中IL-1β或缓激肽诱导的前列腺素E2的产生，表明ROCK1和ROCK2在关节炎疼痛中起重要作用［9］。在Monoiodoacetate诱导的大鼠关节炎模型和链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱发的神经痛模型中，单次给与AS1892802，即可显示短暂的止痛效应，重复给药，则可发挥较强的持续的镇痛效应，在末次给药后，其镇痛效应还能维持数日，证明外周ROCK在慢性疼痛的持续过程中，发挥重要作用［10］。

最近转基因动物实验研究结果也证明，RhoA GTPase-激活蛋白 DLC2（deleted in liver cancer 2）通过抑制 RhoA和ERK活性防止疼痛反应的扩散，在调控炎症性疼痛中起关键作用，DLC2（－／－）转基因小鼠为今后研究调控炎症性疼痛提供有价值的动物病理模型［11］。

1.2 Rho激酶与糖尿病性神经痛 糖尿病性神经病变是糖尿病最常见的并发症之一，引发患者日常生活中的诸多问题，严重影响患者的生活质量。对RhoA／ROCK信号通路在糖尿病的热性痛觉过敏的影响研究结果显示，在STZ诱导的糖尿病小鼠脊椎中的膜结合RhoA水平明显升高，采用RhoA抑制剂胞外酶C3（exoenzyme C3）和肉毒梭状芽胞杆菌（Clostridium botulinum）及Y-27632处理时，明显降低热痛觉过敏和机械性痛觉过敏。5-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMG-CoA reductase）抑制剂辛伐他汀也能改善糖尿病小鼠的上述症状，提示ROCK抑制剂和HMG-CoA还原酶抑制剂可能是减轻糖尿病神经病变疼痛症状的有效化合物［12］。RhoA／ROCK信号通路可能参与了调控糖尿病神经痛的脊椎痛觉传递。这些发现为糖尿病神经痛提示了新的治疗策略。

1.3 Rho激酶与血管痉挛性心绞痛、脑血管痉挛 冠心病心绞痛的发生，主要是因为冠状动脉狭窄和（或）痉挛造成的心肌缺血、缺氧引起。长期给予Rho激酶抑制剂法舒地尔（8周），能够逆转实验猪的粥样硬化冠脉痉挛、损伤、压力重构等血管性疾病的发展，对抗心肌缺血［13］。口服法舒地尔4周能通过减轻血管炎性反应、减少胶原沉积、对抗巨噬细胞迁移，防止猪冠状动脉支架植入术后再狭窄和损伤［14］。在犬冠脉左前降支结扎致心肌缺血模型上，盐酸法舒地尔和羟基法舒地尔均可改善心电图ST段降低，增加局部心内膜血流［15］。

Yamaguchi等［16］的研究表明，在C6神经胶质瘤细胞中，ROCK调控TNF-α诱导的IL-6的产生，提示ROCK抑制剂有可能成为治疗脑血管痉挛及其他中枢神经损伤的候选药物。

1.4 Rho激酶与癌痛 嗜神经侵袭（perineural invasion，PNI）是指肿瘤细胞侵袭和转移到神经系统。发生PNI是肿瘤恶化的标志，也是胰腺癌、结肠癌、胆癌、胃癌和直肠癌等多种恶性肿瘤所特有的病理改变。神经和入侵肿瘤细胞之间存在信号传导，恶性肿瘤PNI严重限制肿瘤的局部控制，导致肿瘤的疼痛、复发和转移。神经营养因子、黏附因子以及金属蛋白酶等在PNI中起重要作用。最近研究表明，丛状蛋白（plexin-B1）和脑信号蛋白（semaphorin）4D通过RhoA／ROCK信号通路促进PNI，提示了RhoA／ROCK信号通路在肿瘤的疼痛、复发和转移中的重要作用［17］。

骨癌痛（bone cancer pain，BCP）严重影响癌症骨转移患者的生活质量，且部分患者的镇痛治疗方法通常也不规范［18］。研究表明［19］，转化生长因子和 ROCK依赖机制参与转移性肿瘤细胞到刚性矿化骨基质的侵袭过程。最近研究人员采用胫骨内注射Walker256细胞的方法，建立大鼠BCP模型，到d 9时鞘内注射10 pg RhoA抑制剂C3外酶，发现其不仅能够缓解模型组大鼠的癌性骨痛行为，而且明显降低模型组大鼠升高的脊椎RhoA和ROCK2蛋白水平。而预先鞘内注射1.5 pg RhoA激动剂U-46619时，上述作用完全被抵消，说明脊椎RhoA／ROCK信号通路可能参与了BCP的发生过程。这些结果提示，干预RhoA／ROCK信号通路有可能成为预防和治疗BCP的新策略［20］。

1.5 其他 采用神经性和炎症性疼痛以及辣椒素诱导的急性疼痛及机械性痛觉异常超敏等多种不同的疼痛模型进行的研究结果表明，RhoA／ROCK抑制剂法舒地尔（30 mg·kg－1）能够降低大鼠脊神经结扎（spinal-nerve ligation，SNL，77%）、坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constriction injury，CCI，53%）、辣椒素诱导的二次机械性痛觉超敏（63%）、碘乙酸钠诱导的关节炎疼痛（88%）、辣椒素引起的急性退缩行为（56%）等机械性痛觉过敏反应，但不能缓解角叉菜胶注射引起的炎性热痛觉过敏和完全弗氏佐剂（complete freund′s adjuvant，CFA）注射引起的机械性痛觉超敏反应［21］。Y-27632在小鼠热板法和扭体法镇痛实验中的结果也证明，ROCK参与了感受伤害性疼痛的发生过程，ROCK抑制剂可作为新型的镇痛药物［22］。

2 ROCK抑制剂法舒地尔镇痛作用的临床应用

ROCK抑制剂可能作用于多个靶点，通过舒张血管、改善循环、保护神经、抑制白细胞浸润和吞噬而减轻炎症损伤，促进神经再生和神经生长，阻断神经痛的形成和维持，对缺血性卒中、脑和脊髓外伤、炎症和脱髓鞘疾病、神经性疼痛、血管痉挛性疼痛及骨癌痛等起治疗作用。

2.1 脑血管痉挛的治疗 目前已上市的ROCK抑制剂只有盐酸法舒地尔，用于治疗蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛。而另一个ROCK抑制剂Y-27632仅被作为工具药用于医药相关基础研究。

急性缺血性脑血管病是一种发病率与致死率、致残率很高的疾病，目前其发病率还在逐年增加。缺血引发的神经细胞损伤在临床上最为常见。近期的临床治疗结果表明，急性脑梗死发病后72 h内，用盐酸法舒地尔注射液治疗，可改善神经系统症状和体征，减少致残率。有研究表明，治疗组46例中除有3例患者出现轻微心悸不适，1例出现血压轻度下降外，未发现其他明显不良反应，且可以明显改善患者的神经功能状况和临床恢复情况，说明盐酸法舒地尔是一种可用于治疗急性缺血性中风的安全、有效的药物［23］。

法舒地尔通过改善大脑皮质血流、增加缺血脑区局部血流量、抑制脑神经细胞和迟发性神经损伤，从而发挥对脑血管痉挛的缓解及治疗作用。临床研究显示，应用法舒地尔可预防和治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛、支架置入术中的冠状动脉和脑血管痉挛，且对顽固性脑血管痉挛也可能有效。

2.2 血管痉挛性心绞痛的治疗 由于认识到Rho／ROCK在心肌缺血中的重要作用，法舒地尔作为抗心绞痛药物进入了临床试验阶段。口服盐酸法舒地尔治疗稳定型心绞痛的多中心Ⅱ期临床试验结果表明，在Ⅱa临床试验中经过抗心绞痛药物清除期2周后，45例治疗患者（5、10、20 mg，每日3次，连续服用2周）能够明显延长运动时间和心电图ST段呈缺血性压低1 mm所需时间，而服药前后并不影响患者的血压和心率；在Ⅱb临床试验中经过抗心绞痛药物清除期2周后，125例患者的双盲试验也显示相同结果［24］。

血管痉挛性心绞痛是导致急性冠状动脉综合征等缺血性心脏病的主要原因。大量临床研究结果证明，法舒地尔容易被患者接受且无任何严重不良反应，确认新型血管舒张剂-法舒地尔治疗稳定型心绞痛的充分有效性和安全性［24－25］。法舒地尔可防止乙酰胆碱诱导的冠状动脉痉挛，能够治疗血管痉挛性心绞痛患者的心肌缺血［26］，有效治疗冠状动脉旁路搭桥术后的难治性严重冠脉痉挛［27］。

最近的临床研究结果显示，通过检测31例患有血管痉挛性心绞痛患者的白细胞ROCK活性的增加，可预测冠状动脉痉挛性心绞痛的存在和严重程度，使用解痉剂治疗后这些患者中ROCK活性明显降低，证明了ROCK在血管痉挛性心绞痛中的发病机制，并确立了白细胞ROCK活性可作为血管痉挛性心绞痛的生物标志物的临床证据［28－29］。

2.3 糖尿病性外周神经疼痛的治疗 糖尿病外周神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症，以肢体疼痛、麻木为突出临床表现，其中以远端对称性、感觉运动性、多发性周围神经病变最常见。临床观察结果表明，盐酸法舒地尔联用弥可保治疗糖尿病周围神经病变疗效明显。与治疗前比较，患者肢端疼痛、麻木、乏力等症状得到明显改善，总有效率达97.2%，且神经传导速度明显改善，在治疗过程中无不良反应发生，安全可靠，是糖尿病周围神经病变的较为理想的治疗方法，可有效改善临床症状，提高患者生活质量［30］。

3 结语与展望

综上所述，Rho／ROCK信号通路在疼痛的产生和持续过程中起重要作用，多项临床实践和案例也证明了ROCK抑制剂在预防和减轻疼痛方面的有效性和安全性。研究和开发选择性更强的新型ROCK抑制剂在临床镇痛方面具有重要的意义和广泛的应用前景，Rho／ROCK信号通路为研究和治疗疼痛提供新的思路和策略。

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