NK细胞受体及其配体与结核分枝杆菌感染①

严 妍 王 易 刘 丹(上海中医药大学免疫学与病原生物学教研室，上海 201203)

NK细胞是抗肿瘤和病毒感染的重要的固有免疫细胞，也具有重要的抗结核作用。无须预先致敏就可以杀伤被感染的细胞，但NK细胞的有效活化依赖于其激活和抑制信号间的动态平衡，与其激活性和抑制性NK细胞受体(Natural killer receptor，NKR)及其靶细胞表面相应配体的表达或缺失密切相关［1］。在结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，Mtb)感染时，机体的免疫系统会相应发生一系列生理病理改变。NK细胞及其受体、配体也会有相应变化。本文就近年来对NK细胞与Mtb感染的相互关系及NK细胞受体、配体与Mtb感染的相互关系的研究作一简要综述。

1 NK细胞与Mtb感染

NK细胞作为机体免疫系统的重要组成部分，在抗感染、抗肿瘤及移植排斥中起着十分重要的作用。在探索结核病防治的漫长过程中，越来越多的研究者将目光投向NK细胞。希望通过揭示NK细胞的抗Mtb感染机制，实现对结核病更为有效的防治。目前认为，作为重要的固有免疫细胞，NK细胞参与抗Mtb感染的固有免疫过程，对抵抗Mtb感染同样具有重要作用。

1.1 NK细胞参与Mtb感染的发病过程 体内外研究显示，NK细胞参与Mtb感染的发病过程。①对结核患者的研究显示，与健康对照人群相比，肺结核患者外周血NK细胞水平和活性受到抑制，且此抑制与耐药程度相关［2，3］。肺结核患者外周血中的NK细胞水平显著低于非结核患者，且在不耐药肺结核患者的水平明显高于耐药组。研究发现，结核病患者体内髓样树突状细胞和淋巴样树突状细胞数量和功能下调，并可以进一步通过下调IL-12和IL-15等细胞因子分泌，下调NK细胞水平和对Mtb感染巨噬细胞的裂解能力。②NK细胞可被趋化至Mtb感染的肺组织，参与抵抗Mtb感染。因为，在肺结核患者的肺组织中巨噬细胞和NK细胞数量明显升高［4］。体外研究显示，Mtb感染的人树突状细胞(Dendritic cell，DC)可通过释放 IFN-α/β，诱导 CXCL10表达，从而选择性趋化NK细胞［5］。③在结核潜伏感染患者体内，NK细胞可通过调节分枝杆菌特异性CD8+CTL的活性，参与维持Mtb的潜伏感染状态。Vankayalapati等发现去除健康个体来源的PBMC中的CD56+细胞，可导致Mtb特异性CD8+IFN-γ产生细胞的减少，并下调 CD8+T细胞裂解Mtb感染靶细胞的能力。而且在小鼠体内CD8+CTL对于维持Mtb的潜伏状态至关重要［6］。④最近研究也显示，活化的NK细胞可作为重要的固有免疫细胞，参与Mtb相关免疫重建综合征(IRS)的病理机制。因为在经抗逆转录病毒治疗(HAART)后出现IRS的HIV感染合并肺结核的病例中，活化的NK细胞数量明显高于单纯HIV感染及HIV/Mtb共感染患者［7］。⑤在BCG接种的人群中，NK细胞是IFN-γ的主要产生细胞，在抗分枝杆菌的免疫应答中发挥重要作用。文献报道，BCG诱导脐血中NK细胞成熟，增强其细胞毒活性［8］。⑥在体外，NK细胞可促进对细胞内分枝杆菌的杀伤作用，促进对感染的单核细胞裂解，以控制结核分枝杆菌、BCG和鸟分枝杆菌在细胞内复制［9］。

1.2 NK细胞抵抗Mtb感染的可能机制 Mtb可以通过多种途径激活NK细胞。人类NK细胞可以直接与Mtb或Mtb产物相互作用，诱导NK细胞增殖和细胞毒效应。BCG在体外诱导CD56brightNK细胞表达激活性受体NKp44，直接识别细菌成分［10］;也可通过TLR2直接识别Mtb产物，产生应答［11］。此外，NK细胞也可被Mtb感染的单核巨噬细胞或DC激活，发挥细胞毒效应。例如:Mtb的一种重要的38 kD脂蛋白抗原PstS-1可通过刺激单核巨噬细胞活化来加强NK细胞的细胞毒作用和ADCC效应［12］。NKp46、NKG2D等激活受体也可与Mtb感染的单核细胞相互作用，介导 NK 细胞活化［6，10］。

NK细胞亦可以通过多种不同机制抵抗Mtb感染。可发挥免疫调节作用，分泌促炎症和免疫调节性细胞因子及趋化因子，作用于CD8+T细胞等其他效应细胞，调节对Mtb的固有免疫和适应性免疫;也可发挥细胞毒效应，直接裂解Mtb感染的宿主细胞，或直接杀伤细菌，抵抗Mtb感染［13］。大量的实验证据表明，IFN-γ可能是人类NK细胞的主要效应机制，可通过多种机制介导对Mtb的早期抵抗。Mtb感染的PBMC可促进人NK细胞分泌IFN-γ;卡介苗BCG或BCG来源的PPD也可刺激NK细胞产生IFN-γ、穿孔素和粒酶A;肺结核患者的胸腔液中富含的CD56brightCD16+NK细胞是IFN-γ的主要来源;而在小鼠模型中，肺结核早期NK细胞即被激活并分泌 IFN-γ。IFN-γ 的产生有利于［5，14］:①诱导小鼠体内重要介质NOS2的产生，介导对分枝杆菌的杀伤活性;②调节中性粒细胞在肺组织中的浸润和对Mtb的杀伤效应;③调节早期感染的肺组织炎症;④促进CD8+T细胞对Mtb感染靶细胞的杀伤活性;⑤促进单核吞噬细胞产生IL-12和IL-18，诱导保护性Th1应答。在免疫缺陷小鼠，NK细胞也可通过IFN-γ依赖而T/B细胞非依赖的方式抵抗Mtb感染，抑制细菌复制及感染引起的肺损伤。NK细胞是通过CD40/CD40L途径以及细胞因子级联反应活化CD8+T细胞，依赖于NK细胞与被感染单核巨噬细胞间的细胞-细胞间接触，可以被 CD40或CD40L 的抗体所拮抗［6］。

最近研究显示，除了IFN-γ，NK细胞还可通过分泌IL-22，促进Mtb感染巨噬细胞的吞噬溶酶体融合，从而抑制Mtb的细胞内生长［5］。细胞因子IL-15和接头蛋白DAP-10在体外促进Mtb诱导NK细胞产生IL-22。Mtb感染也可诱导巨噬细胞上调表达IL-22R 1，通过此受体促进细菌向溶酶体内递送，促进吞噬溶酶体融合。在BCG免疫的小鼠中，NK细胞对于控制细菌复制、增强IL-22或IFN-γ介导的T细胞应答都具有重要作用。IL-2预先孵育和活化NK细胞3 d后，除了可通过分泌大量IFN-γ促进巨噬细胞活化，还可以促进NK细胞对Mtb感染巨噬细胞的直接杀伤活性［5］。故NK细胞作为重要的固有免疫细胞，参与抗Mtb感染的固有免疫过程，其活化及活化程度与Mtb感染结局相关。故进一步系统地介绍与NK细胞活性密切相关的NKR及其配体，以及其与Mtb感染的关系。

2 NKR及其配体与Mtb感染

对于NKR的描述有不同的分类方法，依据功能不同分为激活性NKR和抑制性NKR，依据分子结构不同分为免疫球蛋白样受体和凝集素样受体。国内较为常用的是以上两种分类方法。但Lewis等［15］将NKR依据其配体的特异性分为MHCⅠ分子的受体(receptors for MHC classⅠ)、MHCⅠ相关分子的受体(receptors for MHC classⅠ-related ligands)和非MHC配体的受体(receptors for non-MHC ligands)。研究发现NKR及其配体表达的差异会影响NK细胞的抗Mtb的免疫效应。多种NKR及其配体参与对NK细胞细胞毒活性和免疫调节活性的调节。

2.1 MHCⅠ分子的受体与Mtb感染 MHCⅠ类分子是MHCⅠ类基因区编码产物的总称，包括经典的MHCⅠ类分子(HLA-A、-B、-C)和非经典的 MHCⅠ类分子(HLA-E、-F、-G)。目前认为它是多种NK细胞受体的配体。现已发现的以MHCⅠ类分子为配体的受体主要包括啮齿类动物的Ly49受体、白细胞免疫球蛋白样受体(Leukocyte Ig-like receptor，LIR)、人杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR)及 CD94/NKG2 受体家族。从功能上分别属于激活性NKR和抑制性NKR，都能特异性识别MHCⅠ类分子。

Ly49分子属C型凝集素超家族，大多数Ly49分子为抑制性 NKR(如 Ly49A［16］)，但也有人在C57BL/6小鼠中发现其家族中Ly49D和Ly49H属于激活性 NKR［17］。Ly49分子大部分识别 MHCⅠ类分子(如H-2K、H-2D)，但也有研究发现Ly49H与鼠巨细胞病毒(MCMV)感染细胞表面病毒糖蛋白m157具有高亲和力［18］。白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)，又称 Ig 样转录物(Ig-Like Transcript，ILT)或CD85。人类 LIRB1-5 为抑制性受体，LIRA1、2、4、6为激活性受体，LIRA3作为一种可溶性分子，作用还不明确。这类受体的配体基本上涵盖了所有的MHCⅠ类分子，包括 HLA-A、-B、-C、-E、-F 和 HLAG［19］。LIRB1还可高亲和力结合UL18，一种由人巨细胞病毒编码的与MHCⅠ结构同源的糖蛋白，可能与病毒的免疫逃逸相关［15］。这两类受体与Mtb感染的关系目前还不清楚。

KIR受体是人类NK细胞高度进化过程中所特有的标志，人KIR基因位于染色体19q13.4，具有广泛的多态性，其家族成员很多。不同成员的胞内段长度不同，一些受体具有含有1个或2个ITIM基序的长(L)胞内段结构域，可转导抑制性信号;其他一些受体的短(S)胞内段结构域不含有ITIM基序，但具有结合带有ITAM基序的接头蛋白DAP12所需的赖氨酸残基，介导激活性信号的转导。其中，抑制性受体有 KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KLRD1/KLRC1;激活性受体有 KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KLRD1/KLRC2，还有一些尚未明确功能的受体KLRC3、KLRC4等，它们能够识别HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E分子，但主要是HLA-C分子［15］。

目前发现KIR受体及其配体的表达，可影响NK细胞活性，与 Mtb易感相关。Portevin等［20］用Mtb H37Rv或BCG刺激健康人外周血来源的NK细胞，在IL-2存在的环境中，均能触发NK细胞释放IFN-γ和IFN-α，但是来源于不同个体的NK细胞对Mtb刺激的反应性相差达1 000倍。进一步分析发现高反应组个体会表达一种或多种非KIR2DS4的激活性受体，如 KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5或KIR3DS1，特别是KIR2DS3和KIR2DS5出现了过表达。提示激活性KIR受体可能作为保护性受体，赋予机体对Mtb感染的抵抗能力。分子遗传学研究则显示，KIR的配体HLA-B35:19/47-C*03单倍型是结核病的易感因素。当HLA-C*03表达升高时，其受体KIR2DL3亦升高，二者间结合可抑制NK细胞活性，与Mtb易感相关［21］。

CD94/NKG2受体家族是国内外研究比较多的一种NK细胞受体，属C型凝集素超家族。在人、大鼠和小鼠均有表达，能特异性识别非经典的MHCⅠ类分子(人识别HLA-E，小鼠为Qa-1)。人类NKG2家族成员(NKG2A、-C、-E和-F分子)通常都与单个CD94分子结合，形成异二聚体［22］，小鼠的单个CD94分子可与 NKG2A、-C 和-E 分子结合［23］。现已研究比较清晰的NKG2A和NKG2B属抑制性NKR，其胞内段含有2个ITIM基序，介导抑制性信号传递。NKG2C、NKG2E和 NKG2H属于激活性NKR，与配体结合后可以招募带有ITAM基序的接头蛋白DAP-12，传递激活信号。NK细胞和T细胞上CD94/NKG2受体的表达受环境中细胞因子的影响，有研究发现IL-15、TGF-β及IL-12在体外均能诱导人T细胞CD94/NKG2受体的表达［15］。

研究显示CD94/NKG2A受体可以负调节NK细胞功能，促使Mtb逃逸NK细胞介导的固有免疫杀伤。李军等［24］用Mtb耐热抗原体外刺激人外周血淋巴细胞，观察其NKG2A和NKG2D受体表达的变化。发现在IL-2和抗原联合刺激下，T细胞和NK细胞表面的抑制性受体NKG2A表达在第12天大幅度上升，NKG2A/NKG2D比例也明显上升。提示Mtb耐热抗原可通过促进抑制性受体NKG2A的表达，抑制NK细胞的活化。

2.2 MHCⅠ相关分子的受体与Mtb感染 MHCⅠ相关分子(MHC classⅠ chain-related，MIC)由MHC的非经典基因区编码，与MHCⅠ类分子结构相似，但不能与肽结合向 T细胞提呈抗原［25］。其成员MICA和MICB是NKG2D受体识别的配体。与MHCⅠ类分子的广泛表达不同，MIC通常仅仅局限地低表达于肠上皮细胞表面。但在肿瘤细胞或多种细菌和病毒感染细胞可被热休克蛋白(HSP)诱导表达，故其作为压力诱导分子，是诱导NK细胞激活的配体［26］。

NKG2D属于NKG2家族，是识别MHCⅠ相关分子的受体。但NKG2D基因与NKG2家族中其他成员(NKG2A、NKG2C、NKG2E和 NKG2F等)的同源性很低，只与NKG2A基因的5'端非转录区有少量同源［22］，所以也被认为是命名不当。NKG2D也不与CD94结合，而是以同源二聚体的形成存在，是NKG2家族中一类特殊的激活性受体。它除了表达于NK细胞，还可组成性表达于CD8+T细胞表面。其表达水平受到环境中的细胞因子的影响，如Zhang等［27］研究发现 IFN-α能够上调NKG2D的表达和而下调抑制性受体NKG2A的表达，而IFN-γ则可下调NKG2D和上调NKG2A表达。也有研究显示其可被 IL-15和 TNF-α 上调，而被 TGF-β下调［15］。

在人类，NKG2D除了识别MICA和MICB，还识别UL16结合蛋白(UL16 binding protein，ULPB)1、-2、-3、-4、-5 和-6［28］。虽然 ULBP 不是由 MHC 基因编码，但结构与MIC相似，都与MHCⅠ具有25%的同源性，属于MHCⅠ家族的远源成员(distant members of the MHC classⅠ family)。其中ULBP-1和-2可以与CMV编码的U16跨膜糖蛋白相结合，MICB亦可。虽然ULBP表达较广泛，但仅能与NKG2D低亲和力结合。当病原体感染细胞时，可诱导ULBP表达增加并聚集于脂筏，增强其亲和力。故与MIC相似，其作为压力诱导分子，与感染诱导的NK活化密切相关［26］。人NKG2D受体与配体结合后，也可招募带有ITAM基序的接头蛋白DAP-10，传递激活信号。在小鼠，NKG2D识别的配体为视黄酸早期转录物(Retinoic acid early inducible transcripts，RAE)成员(RAE-1α、-1 β、-1γ、-1 δ 和-1ε)、次要组织相容性分子H60和小鼠ULBP样转录物1(Mouse UL16-binding protein-like transcript 1，MULT 1)［29］。

目前多个研究都表明NKG2D及其配体的表达与Mtb感染相关。①Mtb感染的单核细胞可促进人NK细胞NKG2D表达增加，而且其配体UL-16和ULBP1也在受感染的单核细胞被上调表达，故NKG2D可能作为主要激活性受体，参与裂解Mtb感染的单核细胞和肺泡巨噬细胞［6］。②活化的NK细胞也可以通过NKG2D依赖的方式直接裂解Mtb产物特异性CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)，并抑制其扩增。其配体ULBP1也可以在Mtb产物特异性Treg细胞上调表达，使用ULBP1抗体可抑制NK细胞对Treg的裂解，表明NKG2D与ULBP1间的相互作用介导对Treg细胞的裂解，并抑制Treg细胞扩增，调节对Mtb的早期应答［30］。③NKG2D还可以促进Mtb感染的人单核细胞和肺泡巨噬细胞分泌IL-23，并促进CD4+T细胞分泌IL-17。此效应可被抗NKG2D或抗ULBP1抗体所抑制［31］。④研究显示，CD8+T细胞的NKG2D表达也与Mtb感染相关，影响CD8+T细胞介导的Mtb保护作用。在体外用抗体阻断NKG2D功能，抑制Mtb特异性CD8+T细胞应答［32］。且与健康对照相比，肺结核患者的PBMC经Mtb体外刺激后，其NKG2D表达增加更显著，在化学治疗阶段表达下调，而在成功治愈的患者则可恢复至较高水平。NKG2D水平可能与Mtb感染和治疗不同阶段，分别受到活菌、死菌、细菌释放的抗原以及免疫病理产物等不同物质的刺激有关，并进一步影响CD8+T细胞的细胞毒作用［33］。

2.3 非MHC配体的受体与Mtb感染 在某些没有MHCⅠ分子以及MHCⅠ相关配体表达的细胞，我们依然能见到NK细胞介导的细胞毒作用，这提示我们除了以上两种配体外，NK细胞还可以通过其他配体被激活、发挥作用。现研究较多的可识别非MHC编码配体的受体有NKR-P1受体、PILR受体、2B4受体、DNAM-1受体及自然细胞毒受体(Natural cytotoxicity receptor，NCR)等，大多都属于激活性NKR。

小鼠NKR-P1受体，又称NK1.1，属凝集素样受体。可以广泛识别自身组织细胞、病毒感染细胞和某些肿瘤细胞上的糖类配体［15］。人NKR-P1受体家族包括NKRP1A、NKp80和NKp65，其配体是C型凝集素样糖蛋白CLEC2亚家族(如:LLT1、AICL和KACL)，CLEC2也是由自然杀伤基因复合体(Natural killer gene complex，NKC)编码，与其相应受体基因紧密连锁［34］。PILR受体，是免疫球蛋白样受体，分为抑制性PILRα受体和激活性PILR β受体，均能同其配体PILR-L结合，而发挥相应效用［15］。NK细胞的这两类受体与Mtb感染间的关系，目前仍无相关报道。

2B4受体，又称CD244，属免疫球蛋白样受体，是淋巴细胞信号激活分子(Signaling lymphocyte activation molecule，SLAM)家族成员，对 NK细胞和CD8+T细胞应答具有重要的调节作用。属于激活性NKR，人类NK细胞能够识别CD48，并激活NK细胞，促使其产生细胞毒作用和 IFN-γ释放［15］。Roy等［30］发现Mtb刺激单核细胞产生的细胞因子可以促进NK细胞表达2B4，但抗2B4抗体不能抑制NK细胞的细胞毒性。对活动性结核病患者及Mtb潜伏感染个体的研究显示，2B4在活动性肺结核患者的CD4+T细胞上的表达显著高于潜伏感染者，且2B4信号对Mtb特异性CD4+T细胞的功能具有抑制作用，可下调其IFN-γ分泌的水平。也有研究显示NK细胞的2B4并不总是展示其对NK细胞的激活效应，当低水平表达时，起激活作用;而当高水平表达时，则产生抑制性信号［35］。DNAM-1受体，又称CD226，属免疫球蛋白超家族。能够识别CD112和CD155。研究表明DNAM-1受体与其配体结合后能增强NK细胞介导的细胞毒作用以及细胞因子的产生［36］。Marras等发现，用 BCG感染人脐血细胞和未成熟NK细胞，可促进未成熟NK细胞DNAM-1表达增加和IFN-γ分泌，与BCG激活免疫应答相关［37］。

NCR受体包括 NKp30、NKp44和 NKp46，其中NKp46和NKp30表达于活化和静止的NK细胞，而NKp44只表达于活化的NK细胞。其配体是目前研究热点，还不完全清楚。NCR受体可识别多种不同来源的配体，包括:病原体(细菌、病毒、寄生虫)来源、肿瘤甚至自身细胞来源。流感病毒的血凝素HA是NKp46和NKp44的配体;NKp44识别登革热病毒和西尼罗病毒的E蛋白;NKp46可识别核粒梭菌和Mtb上的未知配体;NKp30识别疟原虫PfEMP-1蛋白［38］。除了病原体，肿瘤细胞表达的BAT3和B7-H6分子是NKp30的配体;最近确定NKp44的配体NKp44L是表达于多种肿瘤、转化或病毒感染细胞的MLL5蛋白的新型剪接体［39］。

多个研究表明NKp46和NKp44受体可能作为主要的激活性受体，识别Mtb感染的宿主细胞或直接识别Mtb来源的配体，激活NK细胞。①Nazneen等［40］在研究牛结核分枝杆菌时发现，牛 NKp46+CD2-NK细胞对宿主抗Mtb适应性免疫具有重要的调节作用。在感染早期，NKp46+CD2-NK细胞就可以通过选择性表达淋巴归巢因子和炎症趋化因子受体(CCR2、CCR5、CCR6、CXCR3 及 CCR7)促使其向DC细胞的迁移。并通过分泌IFN-γ促进DC表达MHCⅡ分子，参与调节DC的抗原提呈能力。②人NKp46受体可在体外被Mtb感染的单核细胞产生的细胞因子诱导上调，并识别Mtb感染细胞表面的相应配体，介导NK细胞活化，参与裂解Mtb感染的靶细胞，且抗NKp46抗体可以抑制NK细胞杀伤活 性［10］。③Esin 等［10］还 发 现 人 NKp46 和NKp44受体还均可直接识别Mtb来源的配体，参与NK细胞活化和抗结核感染。BCG可在体外诱导CD56bright NK细胞表达NKp44受体，NKp44受体能够识别Mtb细胞壁核心成分分枝酰阿拉伯半乳糖肽 聚 糖(mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan，mAGP)、分枝菌酸(Mycolic acids，MA)和阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，AG)。NK细胞可通过mAGP与NKp44受体间的直接识别被激活，并表达CD25、CD69、NKp44 和 IFN-γ，发挥免疫调节作用。但NKp46识别的Mtb成分目前还尚未确定。④在肺结核患者体内，NKp46和NKp30受体也可能参与对NK细胞的活性的调节。因为，肺结核患者表达NKp30和 NKp46的 CD56brightCD16+/-细胞数量减少，可导致 IFN-γ分泌减少，不利于对 Mtb的清除［2］。

3 小结与展望

从以上各项研究中我们看出，NK细胞在免疫应答中的作用不断受到人们的重视，越来越多的研究者在研究NK细胞受体、配体及其与结核病等感染性疾病间的关系，并致力于更清楚明白的阐释其中机制。我们也不难看出NK细胞主要通过细胞毒及免疫调节作用发挥其功能。对于Mtb感染，NK细胞可被Mtb以及Mtb感染的巨噬细胞或DC细胞直接激活，并直接作用于Mtb感染细胞，发挥细胞毒作用，进而杀灭潜藏在这些宿主细胞内的胞内菌。这为当前的抗结核治疗提供了一条新思路，我们是否可以通过对已感染的吞噬细胞表面NKR配体加以调节，从而触发NK细胞介导抗结核免疫反应呢?在传统的抗痨方剂中是否也存在这样的作用机制呢?目前对传统中医药的研究还鲜有涉及到此方面的，以NKR及其配体为靶标的中药免疫药理研究在重新诠释中药治疗作用及疗效上，在对中医临床疗效的突破上将产生值得关注的重大推动作用。

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