类风湿关节炎中血管新生调节网络及其药物研究启发

孙 艳 安永潼 尹蓓珮 沈龙海

(上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437)

类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，它的发病机制还未完全了解。其病理特点是:滑膜增生、血管新生以及血管翳形成。滑膜增生导致低氧，刺激血管新生，血管新生介导淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等向滑膜迁移形成血管翳，血管翳阻断骨通过滑膜获取营养，激活破骨细胞分化，导致骨和软骨的侵蚀，关节破坏。血管生长是炎性关节炎早期极其重要的阶段。治疗类风湿关节炎的药物从以前的非特异性抗炎药转向特异性抗炎药(如TNF-α阻断剂)，现在，又开始研发作用于炎症信号通路的小分子药物(如Janus激酶抑制剂)。但是存在严重副反应以及某些个体并不反应的缺陷。所以，了解血管新生在类风湿关节炎中的机制以及研发以此为靶点的药物，引领类风湿关节炎治疗的发展是非常必要的。

1 血管新生在类风湿关节炎中的作用

血管内皮生长因子不仅是胚胎生长、骨骼生长、生殖功能等生理血管生长的关键调节因子，也涉及肿瘤、类风湿关节炎和其他的疾病［1］。

近来发现，类风湿关节炎患者中滑液和血清中的VEGF显著增加，而且VEGF含量与疾病的严重程度相关，可以说明血管新生在类风湿关节炎的发展中有着重要的作用。血管新生促进了血管翳的产生和促进炎症细胞向滑膜的迁移加重炎症。RA患者中血管新生的最显著的作用是增加向滑膜增生和血管翳提供营养和氧气。滑膜增生导致滑膜内出现低氧的内环境，低氧诱导因子(HIF)诱导血管生长因子的表达，促进血管新生。但是由于新生血管的间叶细胞的缺乏导致不正常的形态，并没有完全缓解滑膜的低氧状态，导致慢性炎症。

其次，新生的血管可以向滑膜炎症部位输送炎症细胞来维持炎症。VEGF165激活内皮细胞产生趋化因子(如 MCP-1/IL-8)［2］，可以招募单核细胞，然后VEGF165的刺激下或与活化的内皮细胞直接接触产生TNF-α和IL-6，然后TNF-α和IL-6作用于单核细胞分泌VEGF165，形成正反馈。血管新生时细胞因子之间的相互作用使得血管的通透性增加及内皮细胞表面黏附因子的表达，使得炎症细胞转移并透过血管壁进入滑膜炎症部位，使炎症持续［3］。

2 血管新生的分子调控网络

血管生长和成熟是由一系列的配体有序的激活各种受体的过程，受各种信号的调节，其中有参与生长和延伸的，还有调节血管成熟和形态的。有促进信号，同样有抑制信号，两种信号的平衡调节了血管生长。

2.1 血管新生过程 当内皮细胞接受到血管生长因子(如VEGF)刺激时，基底膜外的周皮细胞首先与血管壁分离(在Ang2的刺激下)，然后内皮细胞分泌的金属蛋白酶(MMP)将基底膜分解，导致周皮细胞彻底远离血管壁，内皮细胞之间连接变得松散，内皮细胞屏障的通透性增加［4］，血浆中的蛋白进入并沉积在细胞外基质(ECM)，为血管生成中多种细胞迁移提供纤维支架。新生血管的前端称为Tip细胞，其后的内皮细胞称为Stalk细胞，两者之间的正常比例维持血管正常的形态。参与内皮细胞迁移的因子有VEGF、趋化因子、细胞外基质成分、整合素等。在此过程中还涉及DLL4-Notch信号通路，此信号通路调节Tip细胞和Stalk细胞之间的比例，保证血管形态的正常［5］，对防止内皮细胞的无序增殖和排列有着重要的作用。

延伸血管的稳定性需要周皮细胞和血管平滑肌细胞的支持，招募因子主要是内皮细胞产生的PDGF(血小板来源的生长因子)-BB，PDGF-BB通过碳末端保留模体与ECM中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合与内皮细胞靠近，招募周皮细胞。周皮细胞和血管平滑肌细胞表面表达Ang1与表达于内皮细胞表面的Tie-2受体作用，介导血管的稳定，但是可以被Ang2拮抗，增加BM降解和内皮细胞迁移［6］。

综上所述，参与血管生成的细胞因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、趋化因子、细胞外基质成分及整合素等，而 Ang1和 PDGF-BB参与血管的稳定性。

2.2 血管内皮生长因子

2.2.1 分类及其配体 VEGF家族有 VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD 及 placenta growth factors(PGF)，其受体有Flt-1(VEGFR1)、KDR(VEGFR2)、Flt-4(VEGFR3)、NRP-1。VEGFC 和VEGFD主要与VEGFR3结合，刺激淋巴管生成。与血管新生无关。VEGFA可以结合两种酪氨酸激酶受体-VEGFR1和VEGFR2，VEGFA通过不同的剪切形成多个异构体，其中肝素结合的VEGFA(碱性)异构体可以和 NRP-1结合，加强 VEGFR2信号［1］，而VEGFR1的作用复杂，可以和不同配体结合，产生不同的信号反应，其中研究认为VEGFR1是个“诱骗”受体，可以和 VEGFA结合，抑制 VEGFR2的信号［7］，所以认为VEGFR1是个负调节信号，至少在早期阶段。此外，还可以促进单核细胞迁移，刺激内皮细胞分泌蛋白酶和生长因子［6］。

2.2.2 产生

2.2.2.1 低氧 低氧是血管新生和炎症的关键调节因子，是因为它调控很多基因的表达，包括血管内皮生长因子VEGF。

滑膜增生导致滑膜处氧的消耗大于氧的供给，滑膜处呈现低氧的内环境。低氧诱导HIF的产生。HIF是异源二聚体，由HIFα和HIFβ组成，经研究发现，HIF-1由氧调节的HIF-1α和组成性表达的HIF-1β亚基组成。在常氧的情况下，PHD羟化脯氨酸残基，为von Hippel-Lindau蛋白提供结合位点，招募E3泛素蛋白连接酶，导致HIF-1α泛素化，被蛋白酶降解。FIH-1(Factor inhibiting HIF-1)将HIF-1α天冬氨酸残基羟基化，阻止其与转录辅助激活剂CSP和p300的结合。低氧时PHD和FIH-1失去活性，HIF-1α含量迅速增加，与 HIF-1β结合形成HIF，与助激活剂结合，进入细胞核内，结合低氧反应元件(HRE)，启动基因的表达［8］。

2.2.2.2 生长因子和炎症细胞因子 实验研究发现培养的滑膜细胞能够在 IL-1、IL-6、IL-17、IL-18、前列腺素、TGF-β刺激下分泌VEGF，TNF-α和IL-6刺激单核细胞分泌VEGF165［3］。这些细胞因子通过炎症信号通路或其他信号通路刺激 VEGF的产生。

2.2.2.3 低氧信号和炎症信号相互作用 研究发现低氧信号通路与炎症信号通路存在结合点。有些细胞因子(如 IL-1β和 TNF-α)可以通过 PI3K和MARK两个主要的信号通路影响 HIF的含量［9］，TLR7-TLR8或TLR4的特异性配体会通过NFkB信号通路激活HIF信号通路［10］，所以炎症因子会通过炎症信号调节HIF，从而在常氧的环境中同样刺激VEGF的表达。同样，低氧条件可以直接调控NFkB信号通路，刺激炎症因子的产生，研究认为PHD可以以非羟基化的形式阻断IKK和Hsp90的相互作用，抑制了 IKKβ的磷酸化，从而降解 IkBα，抑制NFkB信号通路。而低氧时，PHD的活性抑制，脱掉对IKK的抑制，激活NFkB信号［11］。

总之，影响VEGF产生的信号可以单独起作用，也可以相互作用，从而形成强大的正反馈，刺激VEGF的产生，促进血管新生和炎症。

2.2.3 信号通路 VEGF-VEGFR信号通路介导内皮细胞的增殖、迁移、抗凋亡、提高血管通透性，也和DLL4-Notch1信号相互作用，共同促进血管正常形态的形成。VEGFR1经历弱的配体依赖的酪氨酸磷酸化，而VEGFR2有着强烈的反应，这些信号转导性质的差异导致VEGF的不同功能，VEGFR1介导细胞迁移和分化，VEGFR2介导细胞增殖和生存。VEGF和其受体结合后，可引起受体胞内激酶区特定酪氨酸残基的磷酸化，进而被含有SH2结构域的adaptor蛋白结合，通过蛋白磷脂酶C(PLC)-蛋白激酶 C(PKC)-Raf-MEK-MAPK旁路，活化 MAPK，MAPK作为转录因子可转运至细胞核内，启动特定基因的表达，完成VEGF相应的促增殖作用。配体-受体结合也可以通过PACK1激活PI3-K，进而作用于Akt，从而介导内皮细胞的抗凋亡，VEGF也诱导内皮细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和A1的表达［12］。研究发现，STAT3也会介导内皮细胞的迁移以及管腔形成［13］。

VEGFA激活的信号诱导新生血管上DLL4的表达，尤其是出芽尖端的内皮细胞(Tip细胞)，DLL4激活邻近细胞表面的Notch信号，从而抑制VEGFR的表达，抑制内皮出芽和增殖［14］。在肿瘤治疗的研究中发现，抑制DLL信号，会产生很多的出芽，但是血管不正常，肿瘤的血液灌流不会增加，肿瘤减小，这为出现VEGF耐受的肿瘤患者提供了新的治疗方法［15］，所以DLL信号在控制血管出芽，保证血管正常形态的过程中起着重要作用。最近结果表明，并不只是VEGFR2调节DLL4，还存在其他调节者(如细胞基质信号)，而且 DLL4信号下调 VEGFR3，对VEGFR2的表达毫无影响，结果显示 VEGFR2和VEGFR3通过Notch信号调节的方式不相同。Notch信号弱时，VEGFR3上调解除对血管新生的抑制，血管Notch或者VEGFR3激活的状态可能会与患者对anti-VEGF治疗没有反应相关，这为我们选择合适的治疗方案来减少耐受产生有价值的信息［16］。但是对于类风湿关节炎中血管新生只会使低氧的状态持续，从而产生慢性炎症，所以我们应该了解新生血管不正常形态的原因，从而根据此原因调节通路，使生成的血管可以输送营养物质，改变低氧的状态，从而可能减轻炎症。

2.3 其他主要细胞因子和蛋白介绍

2.3.1 血管生长素(Ang) Ang1和Tie2(内皮酪氨酸激酶受体)相互作用，促进受体的自身磷酸化(活化)，表达活化Tie2的内皮细胞吸引血管平滑肌细胞、周皮细胞等血管周围细胞包围、支持内皮细胞形成完整的血管壁，促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性和调节血管功能。而Ang2对血管生成的影响和局部的微环境有关，当VEGF等促血管生长因子存在时，Ang2竞争性抑制Ang1，促进新血管形成和血管重建，形成新的毛细血管。当局部缺乏这些因子时，Ang2则通过抑制Ang1而有助于血管的消退［17］。

2.3.2 趋化因子 VEGF可以作用于内皮细胞产生趋化因子，VEGF/VPF可以通过激活NF-kB信号通路(通过钙离子和PI3K)诱导内皮细胞产生IL-8［18］。趋化因子根据半胱氨酸残基在结构中的位置分为三类，分别是CXC、CC、CX3C。趋化因子一方面可以趋化细胞迁移、增加黏附因子的表达，促进炎症细胞聚集，产生炎症。另一方面，可以作用于内皮细胞，产生一系列的信号，促进内皮细胞的分裂、迁移及抗凋亡。研究发现，一般情况下，刺激血管新生的趋化因子包含ELR(glutamy-leucyl-arginyl)氨基酸模体，相反，不含ELR氨基酸模体的趋化因子抑制血管新生。当然也有特例，如 stromal cell-derived factor-1SDF-1/CXCL12缺乏ELR模体，却刺激血管新生［19］。CXCR2是内皮细胞上促进血管生长的CXC因子的最重要的受体，研究发现血管内皮细胞可表达CXC受体mRNA和蛋白，将内皮细胞和IL-8共同孵育可促进凋亡抑制基因的表达，抑制内皮细胞凋亡，还可以加强基质金属蛋白酶 MMP2及MMP9 mRNA的表达，以利于内皮细胞迁移，从而调节血管形成。

2.3.3 整合素 整合素(也称整联蛋白)是一种细胞外基质受体蛋白，细胞外部分与基质蛋白结合，内部通过踝蛋白与黏着斑蛋白同肌动蛋白相连，此过程会激活黏着斑蛋白激酶(FAK)。鉴于FA介导内皮细胞对于细胞外的刺激的重要性及FAK在这个过程的重要性，对于治疗含有血管生成过程的疾病，靶向FAK是有治疗前景的［20］。

3 药物研发方向分析

根据以上结果，我们看到血管新生在类风湿关节炎中的重要作用，鉴于现在类风湿药物主要集中于抗炎药物，会出现耐受及严重的副反应，我们需要研发其他靶点的药物，开发安全有效的产品，所以靶向血管生长或许是一个很好的方向，至少血管生长抑制剂在肿瘤治疗中呈现了很好的效果。

根据调控血管生长的复杂的调控网络，我们可以采取多种干扰策略中断血管生长，抑制血管新生可能会阻断炎症细胞的迁移，减少滑膜处血管翳的形成及炎症的持续。抑制血管新生有以下策略:①抑制血管内皮生长因子(VEGF)的产生，可以通过靶向HIF因子，阻断其信号通路，抑制VEGF的产生。我们研究的方向一方面主要集中在调节PHDs和FIHI的活性，使其在低氧的时候也能破坏HIF-α的稳定性或阻断与助激活剂的结合，从而抑制HIF的存在，中断信号通路。另一方面设计siRNA和DNA转录酶的调节直接靶向HIF的产生［21］。②阻断VEGF-VEGFR信号通路。采用抗VEGF抗体或抗VEGFR抗体阻断VEGF和VEGFR的结合，还可以设计小分子药物靶向受体酪氨酸激酶抑制剂阻断信号通路，抑制内皮细胞的增殖、迁移等。研究发现，通过筛选合成的肽数据库，发现一个可溶性的富含Arg的六肽-RRKRRR(R代表精氨酸，K代表赖氨酸)，它可以和 VEGF结合，抑制其与受体结合［22］，另外还发现抗 Flt-1 的六肽，GNQWFI(Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile)，选择性地阻断Flt-1可能会阻断VEGF诱导的炎症和血管新生，并且毒性会很小［23］。此外，研究发现，金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)最初作为金属蛋白酶的抑制剂，最近发现它可以阻断VEGF和VEGFR2的结合，但对VEGFR1无影响［24］。最奇特的是，可以修饰编码受体酪氨酸激酶超家族的基因，产生理想的剪切变异体，阻断配体与受体的结合。③抑制参与内皮细胞迁移相关的蛋白(如金属蛋白酶抑制剂、αvβ3整合素)等也是一种治疗方案。

由于VEGF-VEGFR信号与其他信号有着紧密的相互作用，在不同阶段，VEGF所承担的作用是不同的，如果只是单一的阻断VEGF，处于特定阶段的患者可能并不会产生效果。对于这个问题，我们应该更加努力地研究类风湿关节炎中血管新生的复杂调控机制，从而详细了解VEGF的多重作用，研发安全有效的药物，避免药物的盲目性。

此外，我们现在主要研究的是血管生长抑制剂类药物，我们可能忽略了血管不正常的形态在疾病发展中的作用，我们知道低氧刺激血管新生是为了提供更多的血液灌流，保证氧的供给，但实际结果却是导致炎症的维持，这是因为不正常的血管失去了它的功能。我们也可以研究造成这种血管不正常的原因，从而采取措施纠正，观察正常的血管新生对于疾病的减轻有无疗效，从而可能开发新的研究思路。其中我们可以从类风湿性关节炎中DLL-Notch信号、Ang-Tie信号的变化入手进行我们的研究，因为它们主要的作用就是调控血管出芽、维持血管完整、促进血管重塑和成熟。

［1］Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J，et al.The biology of VEGF and its receptors［J］.Nat Med，2003，9(6):669-676.

［2］Lee TH，Avraham H，Avraham S，et al.Vascular endothelial growth factor modulates neutrophil transendothelial migration via up-regulation of interleukin-8 in human brainmicrovascular endothelial cells［J］.J Biol Chem，2002，277(12):10445-51.

［3］Yoo SA，Kwok SK，Kim WU，et al.Proinflammatory role of vascular endothelial growth factor in the pathogenesis of rheumatoid arthritis:prospects for therapeutic intervention ［J］.Mediators Inflamm，2008.

［4］Carmeliet P，Jain RK.Molecular mechanisms and clinical applications of angioge-nesis［J］.Nat Rev，2011，473(7347):298-307.

［5］Hellstrom M，Phng L K，Hofmann JJ，et al.Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis［J］.Nat，2007，445:776-780.

［6］Chung A，Lee J，Ferrara N，et al.Targeting the tumor vasculature:insights from physiological angiogenesis［J］.Nat Rev Cancer，2012，10:505-514.

［7］Rey SL，Semenza G.Hypoxia-inducible factor 1 dependent mechanisms of vascularization and vascular remodeling［J］.Cardiovasc Res，2010，86(2):236-242.

［8］Ema M，Hirota K，Mimura J，et al.Molecular mechanisms of transcription activation by HLF and HIF1α in response to hypoxia:their stabilization and redox signal-induced interaction with CBP/p300 ［J］.EMBO J，1999，18(7):1905-1914.

［9］Westra J，Brouwer E，Bos R，et al.Regulation of cytokine-induced HIF 1α expression in rheumatoid synovial fibroblasts［J］.Ann NY Acad Sci，2007，1108:340-348.

［10］Oda S，Oda T，Nishi K，et al.Macrophage migration inhibitory factor activates hypoxia-inducible factor in a p53-dependent manner［J］.PLoS ONE，2008，3:e2215.

［11］Xue J，Li XB，Wei Y，et al.Prolyl hydroxylase 3 is down-regulated in colorectal cancer cells and inhibits IKKβ independent of hydroxylase activity［J］.Gastroenterology，2010，138(2):606-615.

［12］Shibuya M.Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptor(VEGFR)signaling in angiogenesis:a crucial target for anti-and pro-angiogenic therapies［J］.Genes Cancer，2011，2(12):1097-1105.

［13］Yahata Y，Shirakata Y，Tokumaru S，et al.Nuclear translocation of phosphory-lated STAT3 is essential for vascular endothelial growth factor-induced human dermal microvascular endothelial cell migration and tube formation［J］.J Biol Chem，2003，278:40026-40031.

［14］Suchting S，Freitas C，Noble F，et al.The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial tip cell formation and vessel branching［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(9):3225-3230.

［15］Thurston G，Noguera-Troise I，Yancopoulos GD，et al.The Delta paradox:DLL4 blockade leads to more tumour vessels but less tumour growth［J］.Nat Rev Cancer，2007，7:327-331.

［16］Benedito RF，Rocha S，Woeste M，et al.Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling［J］.Nat Lett，2012，484(7392):110-116.

［17］陈立波.血管生成素/Tie2信息通路在血管形成中的调节作用［J］.国外医学·外科学分册，2001，28(1):20-22.

［18］Szekanecz，Zoltan MD，Koch，et al.Chemokines and angiogenesis［J］.Curr Opin Rheumatol，2001，13(3):202-208.

［19］Infusino GA，Jacobson JR.Endothelial FAK as a Therapeutic Target in Disease［J］.Microvasc Res，2012，83(1):89-96.

［20］Konisti S，Kiriakidis SM，Paleology E.Hypoxia-a key regulator of angiogenes-is and inflammation in rheumatoid arthritis［J］.Nat Rev Rheumatol，2012，8:153-161.

［21］Yoo SA，Bae DG，Ryoo JW，et al.Arginine-rich antivascular endothelial growth factor(anti-VEGF)hexapeptide inhibits collageninduced arthritis and VEGF-stimulated productions of TNF-α and IL-6 by human monocytes ［J］.J Immunol，2005，174(9):5846-5855.

［22］Bae DG，Kim TD，Li G，et al.Anti-Flt1 peptide，a vascular endothelial growth factor receptor 1-specific hexapeptide，inhibits tumor growth and metastasis［J］.Clin Cancer Res，2005，11(7):2651-2661.

［23］Qi JH，Ebrahem Q，Ali M，et al，Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 peptides inhibit angiogenesis and choroidal neovascularization in mice［J］.PLoS ONE，2013，8(3):e55667.

［24］Jin P，Zhang J，Sumariwalla PF，et al ，Novel splice variants derived from the receptor tyrosine kinase superfamily are potential therapeutics for rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2008，10(4):73-89.