脑卒中大鼠神经功能修复的行为学评估方法

周佳丽，祝慧凤，万 东，李曼霞，何 坪，徐晓玉

大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型已成为研究脑卒中的理想模型，通过此模型所产生的病理学及症状学改变接近临床脑卒中患者[1]。该模型主要有两种形式：永久性近侧大脑中动脉闭塞(pMCAO)模型和永久性远侧大脑中动脉闭塞联合两侧颈总动脉90 min闭塞(dMCAO/tMCAO)模型。在大鼠脑卒中研究中，pMCAO模型使用频率较高，采用的方法即所谓的“Tamura”法和改良的“Tamura”法[2-3]。该模型可在大鼠背外侧大脑皮质及其下层的纹状体产生相当的梗死面积，此皮质区域与对侧前肢和后肢功能有关，可控制对侧肢体感觉运动行为，而且动物存活时间较长，越有利于脑卒中的恢复研究。尽管有部分研究者对dMCAO/tMCAO这种混合式的缺血变异做过研究，但总的来说对此模型的研究都不是很深入[4-7]，其产生的梗死灶限于额部和顶骨部的新大脑皮质。

大鼠MCAO模型的相关病理生理学已有较为详细的研究和描述[8-9]，其最大的局限在于缺乏一系列持久的、稳定的、适当的评估方法来检测动物大脑局灶性缺血后行为障碍的改善及其对应神经功能的恢复，这就对脑卒中恢复药的药效研究造成了一定困难。虽然病理检测与脑梗死体积的测量也可以成为脑卒中恢复药药效评价的重要手段，但动物行为学的改变与检测在药效研究中是绝对不容忽视的。检测脑卒中恢复药的最佳动物模型应包括一定程度的但不是完全性的恢复，这可能更接近人脑卒中的实际状况。有研究表明，在啮齿类动物模型中脑卒中后的第1周就有一定程度的神经自我修复，一部分正常和接近正常的脑组织同时也会表现出一定的异常功能[10-11]，神经修复程度与鼠龄也密切相关，这就显示单纯依靠病理检测或脑梗死体积的测量来评估药效有一定缺陷。脑卒中模型大鼠的对侧前肢和后肢功能会出现明显的障碍，并且这种功能障碍在1个月左右后出现缓慢、稳定、不完全的恢复，因此在组织学检测之外采用恰当的行为学检测是必要的。

行为学评估分为感觉运动行为评估和认知行为评估：感觉运动行为评估主要偏向于对大鼠视觉、触觉、胡须和本体感受刺激的反应以及肢体运动功能方面的评价；认知行为评估主要偏向于大鼠学习记忆能力方面的评价，如被动回避(passive avoidance)[12]、旋臂迷宫(radial arm maze)[13]、Morris 水迷宫(morris water maze)[14]等。现将国外学者制订的一些感觉运动行为评估方法综述如下。

1 单一性神经行为检测

1.1 神经症状评分类

1.1.1 姿势反射检测 抓住大鼠尾巴，高于桌面10 cm，使其保持较为稳定状态。正常大鼠两个前爪伸向桌面，而MCAO右侧结扎的大鼠，左前爪屈曲。记分标准如下：1分，前肢屈曲，无其他异常；2分，向瘫痪侧推鼠，阻力减小；3分，鼠自由活动时，向患侧打圈[15]。

1.1.2 Berderson评分法[2]轻抓尾巴，提起大鼠高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征+向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状)。

1.1.3 Longa神经病学评分法[16]0分：没有神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展；2分：行走时，大鼠向左侧转圈；3分：行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒；4分：不能自发行走，有意识丧失。

1.2 肢体对称平衡类

1.2.1 升高肢体摆动测试(elevated body swing test，EBST) EBST通常用于不对称的运动行为的测试。将大鼠尾部提起，使其升高到离试验台2.5 cm的位置。大鼠第1次肢体摆动的方向只要被确定为是上身的摆动并且不管朝哪一边，摆动角度大于10°，均被记录下，测试完毕1次放置大鼠于实验台上，接着又重新提高进行测试，每只大鼠给予5 min时间。记录向左或向右转动的次数以及相关百分比反映了大鼠上身肢体摆动的偏好。实验中正常大鼠无典型的朝向偏好，然而单侧脑卒中大鼠则明显表现出向大脑病变对侧偏转的强烈趋向。计算每周测试的平均分作为分析记录。模型大鼠表现出强烈的偏转倾向，即偏向患侧对侧，1周测试的平均分作为最后记录[17]。

1.2.2 平衡木评分法 平衡木反映的是前庭功能及本体感觉的变化，具备一定技巧性。造模前，需要进行为期1周的平衡木练习，让大鼠快速地通过升高的平衡木，进入较暗的饲养箱，并且做好终点线(finish line)的标志。平衡木为长80.0 cm、宽2.5 cm、高2.5 cm的方木棒，行走面相对光滑。升高平衡木到距离地面1 m处，下方固定，用泡沫做铺垫，防止大鼠行走时跌下。每次测试时大鼠连续3次通过平衡木，记录通过平衡木的潜伏期以及通过时大鼠前肢或后肢踩空(foot faults)的次数。除此之外，若用评分标准则分为6个等级：0分，能跳上平衡木，在上面行走不会跌倒；1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会少于50%；2分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会大于或等于50%；3分，在健侧后肢的帮助下能跳上平衡木，但受累瘫痪侧后肢不能帮助向前移动；4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分，将大鼠放在平衡木上会掉下来。正常大鼠一般能在平衡木上平稳地通过，而模型大鼠通常前肢或后肢踩空，甚至从平衡木上滑落下来。3次测试结果的平均分作为最后成绩[18]。测试时间为术后治疗前7 d或15 d时以及治疗后4周或9周时。

1.2.3 肢体对称测试 将大鼠放于一定规则的铁丝网中，网眼大小为2.3 cm×2.3 cm。当大鼠在网中行走时，计数2 min内其前爪漏到网眼中的次数。计数公式：(脑病变对侧前爪的错步数-脑病变同侧前爪的错步数)/总步数；分值为正表明脑病变对侧功能缺损；分值为负表明脑病变同侧功能缺损[19]。

1.3 肢体运动能力类 肌力检测：将一直径为0.15 cm、长46 cm的铁丝绳置于距地面70 cm处，其下放3.5 cm泡沫箱。将鼠前爪放在绳上，放开，记录大鼠在绳上的时间。0分：挂于绳上0～2 s；1分：3～4 s；2分：5 s；3分：5 s后大鼠将后腿放在绳上[20]。

2 复合性神经行为检测

2.1 感觉运动整合类 感觉运动整合是指透过视、听、嗅、味、触、重力感等感觉器官接受外界环境的讯息(刺激)，经由感觉神经传达到大脑、脊髓等中枢神经。经由大脑整理、组织后，透过运动神经做出对外界讯息的一种反映。而经由各种讯息的刺激，大脑加以整理、储存、技艺、学习，完成整个神经系统的连接与健全，奠定大脑组织架构的完成，这个过程就叫感觉整合。训练和测试方式通常有圆筒测试(cylinder test)、安置测试(placing test)等，反映感觉功能、本体感功能、空间知觉功能等。

2.1.1 圆筒测试 本实验是Schallert等[21]设计研制的，将大鼠放于一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃圆筒内，圆筒直径为18 cm、高30 cm，同时用摄像机记录大鼠在其中的活动情况，时间为3～5 min，分析大鼠使用前肢的偏喜情况及不对称或偏位状态。该圆筒对大鼠来说有足够的活动空间，同时又促使其对侧壁进行探视，并使其无法爬到圆筒的顶部。在圆筒的背后直立一面镜子，便于当大鼠背对摄像机时实验员记录其前肢活动的状况。在观察过程中，大鼠使用一侧前肢或双侧前肢竖立触壁(vertical exploration of the walls)及触底(landing)的数量均被记录。当大鼠在圆筒中探视时，第1次将某一前肢放置在侧壁上时，该行为被记录为“independent wall movement”1次，接下来如果大鼠又将另一侧前肢放置在侧壁上，而先前的那侧前肢又没有放下或移开，该行为被记录为“simultaneous limb-use movement”1次。依次按照此类方法记录前肢情况。在大鼠偶然对侧壁探视完后，第1次将某一前肢放置圆筒底部时，该行为被记录为“landing”1次，如果两前肢同时接触底部，该行为被记录为“simultaneous limb-use”1次。不确定和判断困难的动作不纳入记录范围。

最后将记录的次数进行统计分析：(1)使用非受损前肢的活动次数与活动次数的总数作比较；(2)使用受损前肢的活动次数与活动次数的总数作比较。使用非受损前肢的百分比数减去使用受损前肢的百分比数得出全部前肢偏喜程度。前肢触壁及触底的情况再分别独立分析。1周测试1次，每次让大鼠探视2次，2次的得分计算平均分作为最后统计结果。测试时间为术后7、14、21、28 d。

2.1.2 安置测试 该实验是由De Ryck等[22]设计的，该实验中能反映与视觉、胡须触觉、本体触觉以及本体感受刺激相对应的独立的前肢安置状态。同时与肢体触觉和本体感受刺激相对应的后肢安置状态也同样在该测试中得到反映。检查前肢安置状态时，将大鼠的躯干升高一定高度，保持前爪自由悬空，然后慢慢移向桌面边缘，让其触须与桌面边缘做短暂接触(一种是视觉诱导的安置，另一种是触须感应诱导的安置)，同时将前爪与桌面边缘做轻微的接触(这是由肢体触觉诱导的安置)，接着保持这一状态，在前肢上不断施加压力(这是由本体感受诱导的安置)。用同样的方法测试后肢安置状态(由肢体触觉和本体感受诱导的安置)。在前后肢的每只爪上重复测试6次，不管哪一只爪，直到出现3次正确的安置即可。每次测试记录完全安置的3次，1周计算得分，平均值作为统计分析记录。

2.2 细微运动协调类 细微运动协调指先对实物或图解的细微部分具备正确的知觉感受能力和比较辨别能力，然后能正确而迅速地使眼和触觉或嗅觉与肢体运动相协调，并迅速完成操作的能力。

2.2.1 单个小丸作业(single pellet task) 测量模具的制作采用透明的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃箱，尺寸为45 cm×14 cm×35 cm。在玻璃箱正前面的中央有一1 cm宽的缝隙条，从离地面2 cm处升高到离地面15 cm处。在容器外侧即裂缝前端，装上一离地面3 cm高、2 cm宽的横条架，然后在1 cm宽的缝隙条两侧各向外延伸1 cm处分别作一条划痕，小丸最开始置于这两条划痕处的横条架上，一旦大鼠在抓取时表现出了某一前肢偏喜后，小丸就放于偏喜前肢的对侧。每次放置小丸时，有较短时间的间隔，这将刺激大鼠每次抓取后返回容器中探视，之后重新调整姿势准备下次的抓取。每天训练1次，每次给予10 min的抓取时间，连续抓取20粒小丸作为完全成功的记录，抓取成功率的计算方法为：成功率=(每次抓取的数量/20)×100，最后结果做统计比较[23-24]。

2.2.2 托盘作业(tray task) 测试模具为一长26 cm、宽19 cm、高28 cm的铁笼。容器的正前面由宽2 mm的竖栏杆支撑并且两栏杆之间有9 mm宽的缝隙。顶部由透明的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃构成，便于观察。在正前面栏杆的前面装有一宽4.0 cm、深0.5 cm的托盘，在铁笼的后部有供水处。每次装30 mg食物，大鼠能自由从栏杆空隙中伸肢抓取食物并获得食物，每天坚持1 h的训练，连续7 d。测试时每只大鼠给予10 min的时间，评估方式：如果前肢伸过栏杆空隙，但是未抓到食物或食物滑落，被计为“reach”；如果获得食物并且吃掉计为“hit”，用下列公式计算：Percent success=(number of hits/number of reaches)×100，最后进行统计分析。在训练和测试时，保证大鼠处于空腹状态，且连续下来体质量不能减轻到原体质量的85%[23，25]。测试时间为术后1、3、7、15 d，或治疗后4周甚至9周。

2.2.3 楼梯抓取技能测试(staircase skilled-reaching test) 在阶梯测试和训练期间，大鼠的食物要限制在12 g/d，每天记录体质量，体质量不能下降到原始体质量的80%。在造模前2周开始训练，每次训练时间为2～15 min，让大鼠抓取阶梯上的小丸。测量模具由7步台阶组成，每步台阶上放有3粒小丸。staircase装置固定于大鼠的任意一边，要求大鼠必须爬上台阶的中心平台去获取食物。以大鼠每边获取小丸的数量用来作为前肢抓取能力的测量。在手术造模后，治疗的前1周进行测试，连续5 d，每天测试2次，每次记录每只大鼠的抓取量，然后进行统计分析比较[26-27]。

综上所述，一系列有关神经功能修复的行为学评定体系正在逐步成熟。这些测试以不同的程度和形式追踪实验性大鼠脑卒中后各种类型的行为改变，对治疗因素的效果评估具有相对足够的敏感性。将行为测试与组织病理观测、脑梗死体积测定这两者紧密地、分区域地联系起来，使形态学的论证依据变得饱满，让治疗因素的优势具有充分的说服力，也利于实验者的分析比较。这些行为测试不是独立的，若能有效、合理地将之进行联合搭配，这将对脑卒中模型动物的感觉运动行为评估开辟更为宽阔的前景。

目前仍存在一些问题值得探索。一方面在选择上：(1)国内外文献对实验性脑卒中的研究在急性期与慢性期的时间分隔上未能有较深入的阐述；国内部分相关实验大多基于大鼠脑卒中急性期即相对较短期限的研究，常忽视了慢性期这一疗效评估的重要时期。这也造成了实验与临床脱轨的尴尬局面，即人体给药时间和剂量难以从大鼠模型上进行外延与扩展；(2)由于对前述的急性期与慢性期的问题未进行深入研究，使得部分实验研究在较长时间治疗后仍然采用较为单一的简单神经反射评分进行行为学评分，因存在自我修复及正常部分代偿的问题，即在7 d左右，脑卒中大鼠的某些神经症状就已经自我恢复正常了，所以用前述方法极为不科学，并且结果常产生一定的误导作用。什么时期采用何种评价方式是亟须解决的问题。另一方面，在操作上，上述一系列感觉运动评估方式皆具有一定的主观性和对实验者的依赖性，其结果的重复性相对较为困难，对动物的饮食、活泼度、实验员的主观能动性均有一定要求。因此，如何更客观、更量化、更有可操作性及重复性，也有待解决。

总之，合理选择与客观操作，独立、重复、盲法及随机的原则都是在实验中需坚持的。随着现代生物科学技术的发展，行为学检测模具及相关机制的研究将被进一步深入与创新，行为学发展的蓝图也更加令人期待。

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