酶标免疫实验假阴阳性的原因探析

王有美

（平湖市第一人民医院，浙江 嘉兴 314200）

酶标免疫实验假阴阳性的原因探析

王有美

（平湖市第一人民医院，浙江 嘉兴 314200）

现代医学检测技术在过去的几十年有了飞速的发展，一些先进的实验检测在学校和医学研究所等地方较为常见，研究酶标免疫实验有助于提高我国实验检测技术。酶标免疫是通过相应的特异性抗体对组织及细胞中的抗原或半抗原进行检测。然而，假阴阳性是酶标免疫实验中较为常见的现象，分析其产生原因有着重要的意义。本文主要结合实际实验经验，从遇到的假阴阳性进行分析影响因素，从而提出避免酶标免疫实验出现假阴阳性的具体措施，为实际实验提供参考和指导。

酶标免疫实验；假阴性；假阳性；原因；改善措施

随着现代检测技术在医学实验中的普遍使用，实验检测能够更好的为医院、学校和科研单位提供服务[1]。酶标免疫实验在实际中有着广泛的应用，属于较为常见的实验检测技术，它在病理诊断时起到重要辅助作用[2,3]。检测过程中每一步的规范直接关系到到检测结果的准确性，从而在某些程度影响到病理常规诊断，这就要求酶标免疫实验做到严格的规范，防止出现不准确的检测结果[4]。假阴性和假阳性是酶标免疫试验检测中最容易出现的现象，直接影响了酶标免疫试验检测准确性[5]。本文主要分析了酶标免疫实验中影响假阴阳性的因素，并结合实际工程分析了改善措施，为实际酶标免疫试验检测提供指导，提高实验检测水平。

1 酶标免疫试验检测假阴阳性原因分析及改善措施

假阴阳性现象在酶标免疫试验检测中是一个综合现象，该现象不仅与实验操作有关，而且与涉及实验结果的各个细节都有影响，在实验检测中较为常见。

1.1 手术标本固定是否充分

标本在送来时马上对标本所在肿瘤位子剖开，让固定液能够充分渗透到组织中去，以保证组织中抗原不被丢失，而且固定液最好用中性福尔马林（研究表明中性福尔马林能够最大程度的保存组织中的抗原），若组织固定的不好，有些组织切片本身抗原含量低的时候，检测结果就有可能显示假阴性的结果，因此组织的固定是前提条件，它在酶标免疫试验过程中起到至关重要的作用。

1.2 组织修复是否恰当

首先要选择什么抗原修复液是关键，组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；一般像细胞质着色的抗体就用柠檬酸修复即可，细胞核/膜着色的抗体用EDTA修复，但主要还要看实际情况，比如有时候试剂的效价低时可适当延长修复时间或者改用EDTA修复来改善，通常情况下用微波炉修复是最方便和节约试剂的，这也是大多数研究单位首选方式，先用高火10 min，再转中火10 min，同时修复时必须保证温度始终达到98 ℃以上（实验时必需保证所用微波炉能够达到所需温度），修复结束后置于常温下自然冷却；经过我多年反复实验，我发现微波修复过程中修复液容易因为持续高温而往外崩，这样容易导致组织片浸不到试剂而暴露在外，就会导致掉片、组织背景出现非特异性着色、该着色的部位假阴性等等一系列问题，因此我建议用高压修复最佳，这样就会避免以上出现的问题，而且修复时温度始终达到100 ℃效果更佳。

1.3 动物免疫血清及过氧化氢的封闭

在组织中非特异性染色是常有的现象，这需要通过动物免疫血清来封闭，一般10～30 min，但是可适当延长时间和适当增加浓度来加强封闭效果，如组织中含较多血细胞（肝胀、肾等组织）就要通过过氧化氢来灭活内源性过氧化物酶以降低背景染色。

1.4 组织的清洗过程

实验时，一抗和二抗的清洗也很重要，PBS清洗不充分，残留抗体结果增强着色，因此以PBS清洗不断地延长时间和增加次数来保证清洗干净，而且最好采用冲洗的方式以避免浸洗时多种抗体交叉结合，造成非特异性染色。

1.5 使用试剂和蒸馏水

在实验操作过程中抗体是最重要两个原因之一，其浓度和质量必需得到首要保证，一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体。现在试剂公司的一抗有即用型和浓缩型，即用型一抗因为试剂的时间和浓度的限制不能调节，所以现在浓缩型抗体为首要选择，使用时要根据抗体的效价及有效期来调整抗体的稀释度，当然，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度；实验时二抗要选择与一抗来源一致的型号，一般情况下选广谱二抗，这样单克隆及多克隆一抗都适用，再者实验时所有试剂都要用蒸馏水来配置，以避免普通水的pH值及其当中杂质的影响，造成非特异性染色。

1.6 DAB显色剂的使用

DAB孵育时间要恰当，过长会使片子整个背景都着色而出现假阳性的情况，过短DAB与链接酶之间结合不充分，会出现假阴性的情况，一般显色时间控制在8～10 min，但是也要根据具体组织片来判断，因此在显色时最好在显微镜下操作，这样能更好掌控显色的程度；在配置DAB时，不是浓度越浓越好，DAB原液与过氧化氢液要1∶1的比例才最佳，以前实验经常有这样的错误的认知，认为DAB原液的比例越高越好，其实不然，DAB原液的浓度过于的高于过氧化氢的浓度反而会使组织着色变弱，从而影响结果判断。

1.7 实验室环境及组织孵育时间的掌控

酶标免疫组化要求实验室环境非常严格，组织必须在恒温37 ℃，湿度合适的环境下进行，一般情况下一抗、二抗的孵育时间分别为1 h和30 min，不过经过不断的实验和总结，我建议一抗4 ℃孵育过夜，这样能使组合织中的抗原与抗体充分结合，而得到最佳显色效果，在实验室整个操作过程中要保证组织不要干片，所以在一抗4 ℃孵育过夜时，必须要用专用的薄膜盖在组织片上，保证试剂长时间在4 ℃低温下不干片，要不然会出现组织的非特异性染色。抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色，这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是很重要。

2 总 结

以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起假阴阳性结果，这就需要新手还是要设置阴、阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的pH值过低及抗体质量等其他原因的干扰。总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的-这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。

实验中，必须根据容易导致假阴阳性的因素，具体针对每种因素进行分析，改善每种可能引发假阴阳性的操作，从而最大程度的保证实验结果的准确性。

[1] 张净.酶联免疫吸附试验检测被检血清的一种非特异性来源-γ-辐射[J].中国动物检疫,1988,5(2):55.

[2] 凤婧,陶传敏,严可宁,等.ELISA一步夹心法检测HBsAg假阴性原因分析[J].华西医学, 2008,23(6):1394-1395.

[3] 薛春杨,周建波.ELISA法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义[J].中国误诊学杂志, 2011,11(16):3913-3914.

[4] 易金平.酶联免疫吸附试验技术的影响因素分析[J].检验医学与临床,2010,7(22):2553.

[5] 杜艳霞.酶联免疫吸附试验测定操作的体会[J].中国实用医药, 2009,4(27):139-140.

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1671-8194（2014）17-0384-02