结核休眠菌的治疗及控制策略

甘易玲,郭述良

目前全球结核病疫情严峻，2011年WHO全球结核病控制报告统计数据表明，全球结核病例共1 200万，其中仅新发结核病达到880万，死亡病例数达140万。世界总人口中有1/3存在潜伏结核菌 (Latent TB infection，LTBI)感染。结核病病程迁延、易复发，且结核病复发有很高比例为内源性复发[1]，而LTBI是关键因素，故消除LTBI对控制结核病疫情至关重要。临床上，目前主要采用长疗程的化疗来彻底清除结核病患者体内的结核菌，但机体仍可能有少量休眠菌潜伏下来，成为以后复发的根源，之所以结核病疗程长，主要是由于潜伏感染的结核菌长期处于休眠和不代谢状态，只在环境合适的时候偶尔繁殖。由于不代谢或代谢十分低下，经典的化疗药物失去作用。而目前用于预防儿童结核菌感染的卡介苗(BCG)对LTBI的复发没有保护作用[2]，所以对无论是否接种过BCG的LTBI，以后均有复发的可能。尤其是合并HIV感染，自身免疫性疾病及器官移植等需要肿瘤坏死因子α(TNF-α)中和疗法、长期大剂量激素等免疫抑制治疗的LTBI者，复发成活动性结核病的风险明显增加。

根据潜伏感染时休眠菌在体内的生长周期，我们将控制结核休眠菌的方法分为：杀灭潜伏期的结核菌；阻止休眠菌复苏；短时间集中复苏休眠菌后再给予杀灭。

1 杀灭潜伏期的结核菌

由于体内潜伏感染时大量结核休眠菌和极少量活动菌共存[2]，所以目前临床主要使用以异烟肼为主的长疗程化疗来杀灭偶尔环境改善后恢复代谢的活动菌，以其彻底治疗结核病。目前临床上还没有可以直接杀灭结核休眠菌的药物，仅有部分可以杀灭休眠菌的药物正处于基础实验或临床试验阶段。

1.1直接用药物杀灭潜伏期的休眠菌

1.1.1硝基类药物 硝基咪唑类对大多数厌氧菌是有效的，而结核休眠菌形成因素之一就是逐渐缺氧，Wayne等人研究发现，虽然甲硝唑不能有效地杀灭结核活动菌，但能有效地杀灭结核休眠菌，联合应用甲硝唑和经典的抗结核药物能有效地杀灭结核休眠菌，并且作用具有剂量依赖性[3]。目前主要研究的硝基咪唑类是PA-824(II期临床试验中)和OPC-67683(III期临床试验中)。PA-824对体内异烟肼、利福平及吡嗪酰胺强化治疗2月的休眠菌和体外低氧诱导的休眠菌均有强的杀菌能力；OPC-67683对耐多药结核病、HIV+的LTBI均有效，并且可以缩短药物治疗时间[4-5]。Grosset等人研究200mg/d 的PA-824或OPC-67683均是安全的，杀菌效果分别是0.098 ± 0.072 log(10)/d和0.040 ± 0.056 log(10)/d[6]。Murugasu-Oei等发现硝基呋喃类药物对结核休眠菌也有抗菌作用，且强于硝基咪唑类(与甲硝唑相比，硝基呋喃对结核休眠菌的抗菌活性高35～250倍)[7]。正处于III期临床试验中的莫西沙星，发现其与PA-824联合应用对休眠菌也有强的杀灭能力[8]

1.1.2二芳基喹啉类药物 此类中，目前研究最清楚的是TMC207，其通过抑制三磷酸合成酶而阻断ATP合成，从而影响细菌能量供应达到杀灭细菌的作用，其对活动菌和休眠菌均有杀灭作用，并且其对耐多药和泛耐药结核菌杀灭作用显著[8]，目前正处于III期临床试验中。

1.1.3其他有潜力直接杀灭休眠菌的药物 在基础实验研究中发现有部分药物或制剂也表现出抗休眠菌的能力。如临床上主要用于治疗低氧实体肿瘤的丝裂霉素C，对结核活动菌和休眠菌均有抗菌活性，而对活动菌的抗菌活性明显高于休眠菌，但与硝基类药物相比，有更低的有效杀菌浓度[9]。属于三氟拉嗪(钙调素拮抗剂)和硫利哒嗪，均是吩噻嗪类药物，前者通过影响细菌的DNA加工、蛋白质和脂质合成以及呼吸代谢，抑制生长期菌、休眠期菌以及多耐药结核菌生长，后者对体外Wayne和鼠休眠菌模型均有抗菌作用[10-11]。

1.1.4杀灭潜伏期的活动菌 目前仍是采用以异烟肼和利福平等药物联合化疗来杀灭潜伏期偶尔繁殖的活动菌。

1.2阻止休眠菌复苏 体内休眠菌在微环境改善，机体免疫力低下时会自动复苏，从而发展成活动性结核病，所以研究者试图通过阻止休眠菌的复苏，让结核菌一直处于休眠状态，从而达到控制结核发病的目的。

1.2.1用疫苗阻止休眠菌复苏

1.2.1.1疫苗的分类及最新研究情况 根据结核病程，疫苗可分为：①感染前疫苗；②感染后疫苗；③多阶段疫苗；④治疗性疫苗。其中①感染前疫苗，如目前唯一被批准用于预防结核病的BCG，尽管其基因组中包含有结核菌相似的DosR及其调节子，但研究发现其不能用于预防LTBI的复发，即对潜伏期没有保护性免疫[2]。而目前正处于临床试验的8项感染前疫苗中，没有可以将感染的结核菌完全清除机体的疫苗，而仅通过增强免疫力，提高了机体本身清除结核菌的能力，其中一部分结核菌在高免疫压力情况下进入休眠状态与机体免疫力达到平衡，而降低活动性结核病的发病率[12]。但在某种程度上却增加了LTBI的数量，未从根本上控制休眠菌。②感染后疫苗。主要是针对潜伏期休眠菌的疫苗，增强机体对休眠菌的清除能力，但此期结核菌处于休眠状态，不代谢，不仅对药物不敏感，对机体免疫力也耐受，所以想彻底靠疫苗清除休眠菌很难，仅能通过增强此期免疫力而阻止休眠菌复发，让其一直休眠[13-14]。③多阶段疫苗。因注射感染前疫苗的结核感染者易发展成潜伏感染，而潜伏感染又需注射疫苗，所以研究者设想设计一个疫苗包含针对这两个时期的具有抗原性的蛋白或其DNA，即多阶段疫苗诞生。目前有两个多阶段疫苗(Hybrid 56 in IC31和ID93 in GLA-SE)均处于I期临床试验中[15]。即能同时预防感染者发展成活动性结核病，也能通过产生高免疫压力阻止潜伏下来的休眠菌复苏，从而达到控制休眠菌的作用。④治疗性疫苗。目前有3项治疗性疫苗处于临床试验中，而其中RUTI是唯一一个包含有潜伏期抗原的疫苗，前期实验发现其有治疗LTBI的潜力，目前已完成对RUTI 3个不同剂量(5 μg、25 μg及50 μg)安全性的评估，同时也证实在HIV+免疫力低下人群和HIV-免疫力正常人群中，当皮下注射RUTI后机体均能对多种抗原产生特异性的细胞免疫。综合II期临床试验结果，最终选择单次皮下注射25 μg来进一步研究RUTI的有效性和安全性，目前正处于2个(在印度和南非)III期临床试验中[16-17]。

1.2.1.2用疫苗控制休眠菌的新观点 从以上可知，想通过直接用疫苗杀灭潜伏期的休眠菌是很困难，不现实的。所以有学者认为，因此时休眠菌对免疫抵抗，那么可以通过先用药物(如英夫利昔单抗)适当降低机体免疫压力，改变休眠菌的免疫抵抗，再注射疫苗增强免疫力来杀灭对免疫敏感的结核菌，这样可能更有效地体现疫苗的价值，能更好地控制结核病[15]，此观点仅是理论上的大胆假设，还存在实践及伦理上的争议。

1.2.2用化合物阻止休眠菌复苏 目前已经明确复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)能复苏休眠菌，结核菌中包含5个Rpf，其中RpfB是研究最清楚的。Ruggiero和Mylliemngap等证实了2-nitrophenylthiocyanates(NPT)能通过与RpfB催化部位结合而抑制其促复苏活性[18-19]。目前此法仅用于基础实验，直接将合成的NPT加入Rpf促使体外休眠菌复苏实验中，表现出抑制Rpf促复苏活性，对于复苏机制及是否能够用于抑制体内休眠菌复苏还有待大量实验研究。

2 集中主动复苏休眠菌后再杀灭

2.1通过复苏促进因子复苏休眠菌后再杀灭 正如前面所叙述的，直接将Rpf蛋白加入含有休眠菌的培养基中，即可促使休眠菌短时间集中的复苏，但研究发现Rpf可能具有诱导复苏和休眠的双重作用[20]，所以仍需大量实验来寻找Rpf的最佳复苏浓度。此法所需的纯化的Rpf，现在还没有可以直接购买的商品化制剂，仅来源于实验室的原核表达，或提取对数生长期结核菌上清液作为Rpf混合物使用。目前也尚未有报道将Rpf成功用于复苏体内休眠菌的研究，所以要利用Rpf复苏体内休眠菌，还需要研究其给药效果、剂型、途径和剂量。

2.2通过降低免疫力诱导休眠菌复苏 在人类，仅有5%左右的LTBI者在一生中将复发成活动性结核病，但合并有HIV感染、糖尿病及器官移植需免疫抑制剂治疗等免疫力低下者，极大的增加了复发成活动性结核病的风险[13]。所以通过降低免疫力诱导休眠菌复苏是可行的，目前主要有3种方法可降低机体免疫力：①免疫抑制剂。最常用的是治疗自身免疫性疾病的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制剂——英夫利昔单抗。通过抑制TNF-α的作用，降低免疫压力，不利于肉芽肿的形成和维持，改善休眠菌微环境而诱导其复苏。国内外均报道在利用英夫利昔单抗治疗类风湿关节炎的过程中，见多数LTBI者发展成活动性结核病。②大剂量糖皮质激素。大剂量糖皮质激素也是通过降低TNF-α水平，而减轻免疫压力。③射线照射。体外用γ射线照射潜伏海分枝杆菌感染的斑马鱼时，通过减少体内的免疫细胞降低宿主免疫力成功诱导了海分枝杆菌休眠菌复苏[21]。

通过以上两种方法成功诱导休眠菌复苏后再给予抗结核药物杀灭，时间短(杀灭生长期菌的时间一般是1月)。

综上所述，通过直接杀灭潜伏期休眠菌的药物，有望将杀灭结核菌化疗疗程缩短到2月，时间短，且彻底除菌，是比较理想的治疗休眠菌的方法。尤其是TMC207，其对耐药结核菌及泛耐药结核菌有较好的杀灭作用。随着耐药结核的日益增加，TMC207更有益于结核病的控制。但还有待临床试验的最终结果来评价新药在控制休眠菌中的应用前景。而采用抗活动菌的化疗药物来杀灭偶尔环境改善后自动复苏的休眠菌。因此时复苏依赖于休眠菌环境的自然改善，时间长，易变化，难以规范用药，所以还需要其他治疗LTBI的方法。而将阻止休眠菌复苏的方法，因不能预测休眠菌复苏时间，需反复给予疫苗或药物，繁琐，且不能彻底除菌。尽管有部分针对休眠菌的疫苗正处于临床试验中，但疫苗面临一个极大的考验就是，当合并其他微生物感染的LTBI者是否会影响疫苗的保护性免疫效果及安全性，比如HIV+的LTBI者，因减少了体内CD4+T淋巴细胞的数量而影响疫苗的保护性免疫作用。所以也需要等待进一步的临床试验结果来评价疫苗的应用价值。而通过应用Rpf抑制剂阻止休眠菌复苏的方法目前仅处于实验研究阶段，想通过给予化合物来抑制休眠菌复苏，需长期给药，否则血液药物浓度降低后休眠菌又会在微环境改善、免疫压力降低的时候复苏，所以此法不现实。但可以通过对阻止复苏机制研究的不断深入试图找到新的治疗休眠菌的药物靶点。而短时间集中复苏休眠菌后再予以杀灭，时间短，且彻底除菌，是比较理想的方法。目前可成功诱导休眠菌复苏的方法是降低免疫力疗法，但此方法必须在明确对象是LTBI患者的前提下给药，而目前还没有诊断LTBI的金标准，所以也需综合病史、临床表现及实验室检查等来综合判断。但就单纯结核菌潜伏感染的患者，仅仅为诱导潜伏感染的休眠菌复苏而主动降低免疫力可能带来的弊大于利，是不合理论和伦理的。所以也再次强调不是每一位LTBI患者均需要治疗，一定评价不同治疗方案带来的利与弊。临床在使用免疫抑制剂或大剂量激素治疗其他疾病患者时，也应在用药前排查有无LTBI或用药中密切监测有无结核病的表现，做到早诊断，早治疗。

参考文献：

[1]The Chinese center for disease control and prevention of tuberculosis prevention and control center. Epidemiological sampling survey results introduction of national fifth tuberculosis[M].Beijing:TB prevention and control in China,2011, 3:14-16. (in Chinese)

中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心. 全国第五次结核病流行病学抽样调查结果简介[M]. 中国结核病预防控制, 2011, 3: 14-16.

[2]Lin MY, Ottenhoff TH.Not to wake a sleeping giant: new insights into host-pathogen interactions identify new targets for vaccination against latent Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Biol Chem, 2008, 389: 497-511.

[3]Wayne LG, Sramek HA. Metronidazole is bactericidal to dormant cells ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1994, 38: 2054-2058.

[4]Rivers EC, Mancera RL. New anti-tuberculosis drugs in clinical trials with novel mechanisms of action with novel mechanisms of action[J]. Drug Discov Today, 2008, 13: 1090-1098. DOI: 10.1016/j.drudis.2008.09. 004

[5]Okada M, Kobayashi K. Recent progress in mycobacteriology[J]. Kekkaku,2007, 82: 783-799.

[6]Grosset JH, Singer TG, Bishai WR. New drugs for the treatment of tuberculosis: hope and reality[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2012, 16: 1005-1014. DOI: 10.5588/ijtld.12. 0277

[7]Murugasu-Oei B, Dick T. Bactericidal activity of nitrofurans against growing and dormantMycobacteriumbovisBCG[J]. J Antimicrob Chemother, 2000, 46: 917-919.

[9]Peh HL, Toh A, Murugasu-Oei B, et al.Invitroactivities of mitomycin C against growing and hypoxic dormant tubercle bacilli[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45: 2403-2404.

[10]Advani MJ, Siddiqui I, Sharma P, et al. Activity of trifluoperazine against replicating, non-replicating and drug resistantM.tuberculosis[J]. PLoS One, 2012, 7: e44245. DOI: 10.1371/journal.pone.0044245

[11]Sohaskey C. Latent tuberculosis: is there a role for thioridazine?[J]. Recent Pat Antiinfect Drug Discov, 2011, 6: 139-146.

[12]Kaufmann SH. Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box[J]. Immunity, 2010, 33: 567-577. DOI: 10.1016/j.immuni.2010.09.015

[13]Andersen P. Vaccine strategies against latent tuberculosis infection[J]. Trends Microbiol, 2007, 15: 7-13.

[14]Kaufmann SH. Tuberculosis vaccine development: strength lies in tenacity[J]. Trends Immunol, 2012, 33: 373-379. DOI: 10.1016/j.it.2012.03.004

[15]Kaufmann SH. Tuberculosis vaccines: Time to think about the next generation[J]. Semin Immunol, 2013.DOI: 10.1016/j.smim.2013. 04.006 [Epub ahead of print]

[16]Cardona PJ. Fase II de la vacuna Ruti. [EB/OL]. [2013-07-01]. http://www.aspb.es/uitb/DOCS2/pjcardona.pdf

[17]RUTI. Pipeline Report-the 2013 Pipeline Report[EB/OL]. [2013-07-01]. www.pipelinereport.org/browse/tb-vaccines/ruti.

[18]Ruggiero A,Marchant J,Squeglia F,et al. Molecular determinants of inactivation of the resuscitation promoting factor B fromMycobacteriumtuberculosis[J]. J Biomol Struct Dyn, 2013,31: 195-205. DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.09.134

[19]Mylliemngap BJ, Borthakur A, Velmurugan D, et al. Insilico analysis and molecular docking of resuscitation promoting factor B (RpfB)[J]. Bioinformation, 2012, 8: 646-651. DOI: 10.6026/ 97320630008646

[20]Er J, Zhu XW, Liu ZQ. Resuscitating effect for dormant tuberculosis by recombinant resuscitation promoting factor (Rpf) proteins[J]. China Med Engineer, 2008, 16: 92-95. DOI: 10.3969/j.issn.1672-2019.2008.02. 005 (in Chinese)

佴静,朱雪薇,刘忠泉．复苏因子促进休眠结核杆菌复苏作用的研究[J].中国医学工程,2008, 16: 92-95. DOI: 10.3969/j.issn.1672-2019.2008.02. 005

[21]Parikka M, Hammarén MM,Harjula SK, et al.Mycobacteriummarinumcauses a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish[J]. PLoS Pathog, 2012,8: e1002944. DOI: 10.1371/journal.ppat.1002944