问号钩端螺旋体重要蛋白研究进展

曹志强，蒋秀高，张翠彩

钩端螺旋体病(leptospirosis，简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的全球性人兽共患传染病，流行范围广，危害大[1]。在我国，多发生于水稻种植区域，也是洪涝灾害时重点监控的传染病之一。数十年来通过钩体全菌体疫苗的应用, 对控制该病起到了重要作用。国内外均采用当地流行的钩体血清群、型来制备多价钩体疫苗菌苗，但副作用较大，交叉免疫保护作用微弱[2]。目前，许多国内外学者致力于钩体外膜蛋白的研究。外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)位于钩体表面，与宿主细胞直接接触，是抗体和补体的作用部位，在钩体与宿主相互作用的过程中发挥着重要作用。OMPs尤其是不同钩体血清群、型均具有的OMPs是近几年研究的热点领域之一[3]，对抗原结构的分析和属特异性疫苗的研究具有理论指导的意义，对研制通用型钩体疫苗及检测试剂盒中有重要应用价值和现实意义。近年来，随着分子生物学手段、DNA测序技术及生物信息学分析水平的提高，对外膜蛋白的作用机制也不断加深，本文就钩体几种重要蛋白的有关研究成果进行综述。

OMPs按照结构和在细胞的分布可分为3类：第1类为含量较少的跨膜脂蛋白，如OmpL1；第2类为外膜脂蛋白，具有脂质结构，是钩体中含量最多的蛋白；第3类也为外膜蛋白，但是没有跨膜结构和脂质结构，如: OmpA家族蛋白和热休克蛋白。这3类蛋白具有许多共同的特点：都位于细胞膜表面；多数存在于致病性钩体中，不存在非致病性钩体中；核苷酸序列及蛋白质序列高度保守。许多钩体外膜蛋白是研究的热点，如LipL41、LipL32、LipL36、LigA、LipL21、及Loa22等均被克隆及研究[4-8]。

1 跨膜蛋白

钩体OmpL1是在致病性钩端螺旋体中第一个被发现的跨膜蛋白，由320个氨基酸组成，分子量31 kDa。免疫电镜证实:OmpL1定位于钩端螺旋体表面。利用平面脂双层试验证实:OmpL1是一种外膜微孔蛋白，并发现OmpL1编码基因以单拷贝形式存在于所有致病性钩体的基因组中，而非致病性钩体却没有,表明OmpL1蛋白质可能与致病有关。目前认为，OmpL1基因至少包括3种基因型OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。具有OmpL1/1基因型的钩体包括了秋季群和流感伤寒群, 具有OmpL1/2基因型的钩体包括了黄疸出血群、犬群、澳洲群、波摩那群和七日热群[9]，均为我国人群中流行最广的钩体血清群,而具有OmpL1/3基因型的钩体均为国内非主要流行的钩体血清群。因此OmpL1/1和OmpL1/2较OmpL1/3基因型更为适合于研制钩体属特异性疫苗。MAT是在暗视野显微镜下，用活钩体与相应抗体进行的免疫凝集实验，其保护性抗体效价在1∶2以上即有可能有保护作用。Western blot结果表明,兔抗重组OmpL1/1和OmpL1/2血清均能与15群15型中国参考标准株钩体及2群2型双曲钩体国际参考标准株钩体发生凝集反应,MAT效价为1∶2～1∶32，1∶2～1∶16[10]，提示重组OmpL1/1和OmpL1/2为属特异性蛋白抗原并有良好的免疫反应性及抗原性。OmpL1核苷酸测序表明，该基因具有很高的稳定性。不同基因型之间的核苷酸序列差异较大，氨基酸序列分析也与核苷酸分析相符。OmpL1作为一种跨膜蛋白，具有属特异性表面膜蛋白免疫及诊断的特点。免疫印迹试验提示重组OmpL1具有良好的抗原性，ELISA表明: 重组OmpL1可与感染同型钩体的血清发生强烈反应。Maneewatch等[11]，设计了问号钩体黄疸出血群哥本哈型OmpL1的重组质粒DNA疫苗，在对哺乳动物的实验中发现，该疫苗加强了仓鼠免疫问号钩体波摩那群波摩那型能力，但是效果并不理想。单独使用该重组DNA疫苗的效果有待提高，联合其它属特异性疫苗肯效果更好。提示该蛋白可做为广普疫苗和免疫诊断抗原的候选者[12]。

2 外膜脂蛋白

外膜脂蛋白在钩体OMPs中含量最丰富，位于细胞膜上，在钩体粘附、致病和免疫中起着十分重要的作用。类似于其他细菌的外膜脂蛋白，通过N-末端半胱氨酸与脂肪酸共价结合，锚定于外膜外侧或外膜的胞质侧。钩端螺旋体外膜脂蛋的名称命名根据其大致分子量，如LipL21表示大致分子量为21 kDa的一类外膜脂蛋白。具有种属特异性的主要包括LipL32、LipL41、LipL21、LipL36等。

2.1LipL41 LipL41是Shang等首先报道的问号钩体属特异性表面脂蛋白抗原之一, 该脂蛋白序列较为保守, 分子量约41 kDa[13]。我国15群15株问号钩体参考标准株有LipL41/1和LipL41/2两个基因型,前者包括了我国流行最广的血清群[14]。

阮萍等[15]构建了ltBlipL41/1和ctB-liL41/1两种融合基因的原核表达系统, 所表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，但上述表达系统目的蛋白的产量均约为细菌总蛋白10%,有必要进一步研究以提高表达产量。

免疫应答过程中，T细胞和B细胞所识别的抗原表位具有不同特点，分别被称为T细胞表位和B细胞表位。病原微生物感染时,但T细胞在产生高效价抗体过程中的辅助作用不可或缺。因此，若从制作抗原表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)疫苗角度考虑,采用T/B联合表位更为合理和有效。姜久昆等[16]采用生物信息学方法，预测LipL41/1和LipL41/2基因型中T细胞和B细胞联合抗原表位，认为LipL41/1-30和LipL41/1-233的联合抗原表位与不同抗血清的免疫杂交性反应信号较强较稳定，提示这两个联合表位可能是制作钩体MAP疫苗的首选抗原表位。

2.2LipL32 LipL32的分子量为32 kDa，由272个氨基酸组成，是够体中含量最多的OMPs。钩体外膜脂蛋白LipL32只存在于致病性钩体中，在非致病性钩体中未发现[17]。LipL32较其他外膜蛋白在各血清群中保守性高，基因同源性为93.15%～99.16%[18], 蛋白质一级序列同源性为95.12%～99.16%[17]。Seixas等[19]，用表达LipL32的重组卡介苗免疫仓鼠，再用致死剂量的问号钩体哥本哈根型攻击，尸检和组织学检查表明，接种重组卡介苗后，在注射了钩体的动物体内没有找到发生钩体病的证据，进一步证实了LipL32的免疫保护效应。此外，还有文献报道[20]，抗LipL32的单克隆抗体可抑制体外钩体的生长，也间接表明LipL32可诱导免疫保护作。

研究表明，LipL32的N端是由19个氨基酸组成的脂蛋白信号肽及其切割位点, 剪切后可得到成熟功能蛋白,比对GenBank中黄疸出血热群、波莫那群和犬群的3株钩体LipL32的氨基酸一级序列,顺序完全相同[21-22], 说明LipL32的N端高度保守。Hauk等[23]将致病性钩体哥本哈根群FiocruzL1-130株的LipL32 蛋白分成4个片段,包括全长、N端(21～92aa)、中部肽段(93～184aa)和C端(185～272aa),将这4个片段分别克隆到大肠杆菌表达载体中表达, 发现全长蛋白可以检出患者的IgM和IgG抗体,C端肽段可以检出绝大部分患者的IgM和IgG抗体,中部肽段可以检出IgG抗体, 而N端则不能检出IgM和IgG抗体,表明LipL32蛋白的主要抗原表位可能集中在中部肽段和C端。同时研究表达了相对分子质量为32 kD的重组LipL32蛋白, 结果显示其具有良好的抗体结合能力,并且与我国存在的15个血清群的致病钩体抗体均有很好的交叉反应，提示重组LipL32有可能成为良好的血清学检测抗原，应用于属范围内钩体病的抗体初筛。

2.3LipL21 LipL21分子量为21 kDa，由186个氨基酸组成，含量仅次于LipL32。Cullen等(2003年)首先报告了问号钩体黄疸出血群赖型具有LipL21脂蛋白基因,并认为所有致病性钩体均具有该基因及其表达产物。部分研究[24]表明，15群15型问号钩体参考标准株均存在序列高度保守LipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.75%～99.82%和99.46%～100%，提示LipL21基因序列高度保守。LipL21基因表达产物与其它外膜蛋白组分比较，其表达量并不高，按大肠杆菌偏爱密码子改造该基因并进一步优化表达条件，有可能明显提高其产量。Western blot结果表明，LipL21重组蛋白免疫家兔后，能有效地诱导动物产生LipL21重组蛋白特异性抗体并与之特异性结合，提示LipL21重组蛋白有良好的抗原性和免疫反应性。MAT结果证实，兔抗LipL21重组蛋白血清均能与我国15群15型钩体参考标准株发生效价为1∶16～1∶128的MAT凝集反应，表明LipL21是钩体自然状态下表达、位于钩体细胞表面的重要蛋白抗原。

2.4LipL36 lipl36基因在问号钩体不同菌株中的变异较大，阳性检测率为0%～90.91%[25]。提示LipL36的保守性不好。LipL36仅分布在外膜上， LipL36在地鼠体内的表达与感染钩体时钩体的状态有关，感染适应了培养条件的钩体时大量表达，而感染适应了宿主条件的钩体时不表达，且当地鼠温度达到37 ℃时也不表达。在体外培养过程中的表达量也不同：在对数生长早期表达量最大，在对数生长中期就开始下降。这可能与钩体病的慢性感染机制有关，钩体菌通过下调外膜蛋白表达量，逃避宿主的免疫反应，从而在宿主体内长期存活[26]。

2.5外膜脂蛋白小结 穿膜蛋白OMPL1、脂蛋白LipL32、LipL41和LipL21均是钩体表面的蛋白抗原。与其它三种蛋白均具有不同基因型相比，脂蛋白LipL21只有一种基因型。OmpL1、Lip32或Lip41各自不同的基因型型表达产物间均存在相似的MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位。

最新的研究[27]提出，问号钩体赖株感染人单核细胞后，LipL21、LipL32、LipL41 基因mRNA水平迅速并持续下降(P<0．01)，GroEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平瞬时迅速升高(P<0．01)。问号钩体赖株感染人巨噬细胞后主要OMPs抗原表达水平发生明显变化。问号钩体赖株染色体中存在一组调控外膜蛋白表达及组氨酸激酶的基因，其主要功能可能是下调感染过程中部分OMPs抗原表达水平。

3 其它的外膜蛋白

3.1OmpA家族蛋白 OmpA是一种在革兰阴性菌中高度保守的外膜蛋白, 能诱导特异性的体液免疫和细胞免疫, 刺激树突细胞的细胞因子分泌[28]，还能辅助其他抗原内化和交叉呈递以及细胞黏附作用[29]。OmpA家族蛋白，在细胞侵袭、黏附及维持菌体外膜完整性上起着重要作用。具有良好的抗原性和保守性，并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。

钩体赖株基因组中共有8个具有OmpA相关结构域的基因，分别为：LA0056、LA0222、LA0301、LA2215、LA3615、LA3685、LA4337、LB328。其中Koizumi等[30]利用碱性磷酸酶启动子融合表达系统和免疫杂交的方法，从L.manilaeUP-MMC株中筛选出一个编码OmpA蛋白Loa22的基因(gi：LA0222)，并通过免疫印记证实该基因产物可能是致病性钩体中所特有的新型毒力因子，验证Loa22基因可能在钩体感染过程中发挥重要的作用；Omp52(gi：LA3615)也被证实是位于外膜的具有良好免疫原性的抗原。Yang等[31]预测上述的8个基因中的LA0222、LA0301、LA3615和LB328可作为疫苗的候选基因。这4个基因均具有较好的抗原性和保守性。

3.2钩体免疫球蛋白样蛋白 钩体免疫球样(Leptospiral Ig-like,Lig)蛋白，含有一串约90个氨基酸的串连重复序列同源性分析表明，Lig蛋白的重复区域与多种细菌Ig蛋白类似。目前，共发现ligA、ligB及1igC 3种基因，均编码10或11个似Ig的重复序列，其中LigA仅含Ig样区域，LigB在C末端还有一独特非重复区域，1igC变异较多，为假基因。LigA重组抗原均能检测出国内钩体主要流行菌株15群15型免疫兔血清[32]，Lig基因仅存在于各种致病性钩体，非致病性钩体则没有。用免疫细胞化学电子显微镜可观察LigA、LigB位于菌体表面，是表面膜蛋白。

钩体在28 ℃～30 ℃人工培养时几乎不表达Lig，而在动物感染时可在体内大量表达。免疫印迹证实Lig是急性钩体感染时的主要抗原。Kirshneri钩体和问号状钩体减毒后不表达Lig mRNA和Lig蛋白[33]，提示Lig蛋白与毒力有关。

Lig蛋白重复区域类似于细菌毒力因子(如粘附素和侵袭素)的lg样蛋白重复域。Choy等[34]，发现Lig蛋白与钩体黏附宿主相关，可能参与了钩体病发病过程中钩体的最初定植和体内扩散。钩体入侵哺乳动物，Lig蛋白表达增强;不同血清群钩体的病人血清均可与Lig蛋白反应;在钩体豚鼠模型中，Lig蛋白可以诱导针对同源马尼拉型和异源黄疸出血型的保护性免疫反应，这些结果提示，Lig蛋白尤其是LigA可以诱导不同血清型钩体的保护性免疫反应。研究表明[35]，ligA DNA疫苗可产生明显的免疫保护作用，该保护作用有体液免疫的参与和细胞免疫的介导。Foster KM等[36]制作了LigB DNA疫苗，与对照组仓鼠感染钩体全部死亡相比，实验组的保护率为62.5%，P<0.01，提示该疫苗有一定程度的保护作用。

3.3热休克蛋白 热休克蛋白是指细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质，在生物界中高度保守、普遍存在。在感染、发炎等外界压力下，微生物通过增加热休克蛋白合成对其自身产生保护作用，同时可以诱导感染对象强烈的体液和细胞免疫反应。

钩体GroEL蛋白是热休克蛋白家族中的一员，15群15型中国参考标准株钩体中groEL基因且其序列高度保守。问号钩体GroEL位于钩体外膜表面，是诱导宿主体液免疫反应的主要抗原，钩体病病人血清中可检出GroEL抗体。蛋白分子结构分析结果表明，GroEL为外膜蛋白，其96.9%(17/546) 序列位于菌体外。钩体的最适生长温度为30 ℃，而宿主的温度为37 ℃，发热阶段可高达39 ℃，可能与热休克蛋白的作用有关。

以往的一些研究认为，GroEL是人和动物感染期的一个主要免疫原，但无免疫保护作用。最近的研究认为，问号钩体赖株感染巨噬细胞后，LipL21、LipL32、LipL41等外膜蛋白表达水平显著下降,但GroEL表达水平显著升高[27,38]。金地鼠是致病性钩体的易感动物。国内进行了重组GroEL蛋白对金地鼠的免疫保护作用的研究，结果显示100 μg与200 μg重组GroEL免疫的金地鼠存活率分别为50.0%和75.0%。重组GroEL免疫金地鼠血清对实验中8群8株问号钩体的MAT效价为1∶50～1∶400[37]。综上所述，GroEL是序列保守、分布广泛、抗原性较强的蛋白抗原，具备用于研制通用型钩体基因工程疫苗的前景。

4 展 望

2001年10月,我国首先完成了钩端螺旋体黄疸出血型赖株的全部基因组DNA测序和初步功能研究。应用生物信息学推测, 在赖株的基因组中有百余个OMPs编码基因，基因高度保守具有良好免疫原性的OMPs是钩体的重要蛋白，也是当下研究的热门。国内外均采用当地流行的钩体血清群、型来制备多价钩体疫苗菌苗，但副作用较大，交叉免疫保护作用微弱。许多钩体外膜蛋白或外膜脂蛋白具有良好的抗原性和保守性，其抗体具有广泛的交叉凝集作用，多种蛋白抗原联合应用效果可能更好。外膜疫苗正在研究当中，有些已证实具有良好的免疫原性和保护作用，但迄今还没有大规模的进行人体免疫接种。随着社会经济的不断发展，卫生经济学的研究进展，我们越来越需要更加安全、高效、成本低的钩体疫苗。随生物技术的不断进步，在基因和蛋白分子水平对钩体重要蛋白的研究也会更加深入。

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