冀、京、吉犬群犬腺病毒中和抗体调查

钱 方，张守峰，王述超，刘 晔，赵敬慧，米立娟，张 菲，王 颖，扈荣良

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染导致的人兽共患传染病，在世界范围内均有流行。至今狂犬病无有效的治疗手段，一旦发病死亡率几乎为100%。目前，广泛使用的狂犬病灭活苗均为注射剂[1]，对流浪犬及野生动物并不适用。狂犬病口服疫苗已在部分发达国家野生动物狂犬病防控中起到重要作用[2]，其中以犬2型腺病毒(Canine adenoviruses type 2，CAV-2)为载体表达狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的重组活疫苗因其自身优点，得到越来越多的研究应用[1,3-5]。

CAV-2是腺病毒的典型成员，能够高效转导外源基因[6]，感染呼吸道及消化道，诱发粘膜免疫，免疫原性强[7]。此外，CAV-2不能在人体内复制，生产及使用的安全系数极高。本实验室所构建的以CAV-2弱毒疫苗株为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组病毒(CAV-2-RV-CGS)经口服可使犬产生长达两年的有效保护，并经过系统试验，获得农业部颁发的《转基因生物安全证书》[6]。

与其他腺病毒类似，犬腺病毒(Canine Adenovirus, CAV)对犬有较高的自然感染率，且疫苗接种等人为因素也会令犬体内存在CAV中和抗体，过高的中和抗体水平会干扰重组病毒的感染和复制，影响其免疫效果[8]。Akerstedt J于2010年报道斯堪的纳维亚半岛和斯瓦尔巴特群岛60%以上的野生犬科动物呈CAV中和抗体阳性[9]。N. Wright于2013年对南非两个省份的部分犬只CAV-2中和抗体进行调查，分别有45%和62%的犬只存在自然CAV-2感染，且95%的阳性犬只中和抗体≥64[10]，进一步评估体内CAV-2抗体对口服疫苗的影响，试验犬通过疫苗接种感染CAV-2，尽管其中和抗体水平低于自然感染，经单次口服免疫CAV-2-RVG，没有获得针对狂犬病的特异性抗体，结果表明表达RABV-G的CAV-2重组口服疫苗在南非地区不能有效预防犬科动物狂犬病[10]。

为明确我国家养犬体内CAV中和抗体背景，为重组疫苗施用提供数据支持，特选取我国部分狂犬病流行和非流行地区为研究对象，以病毒中和试验对来自河北省、北京市、吉林省等地区城乡犬只血清样本的CAV中和抗体进行定量检测和分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1犬血清及分组 于河北省农村，北京市各区宠物医院，吉林省农村等地随机采取犬血清387份，其中河北省147份，北京市195份，吉林省45份。

1.2病毒及细胞 能够表达绿色荧光蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2-EGFP)由本实验室构建。犬肾细胞系(MDCK)由本实验室保存。

1.3犬腺病毒中和抗体测定试验

1.3.1血清灭活及稀释 将待测血清在56 ℃水浴条件下灭活30 min，对每个样品进行编号。在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL含有3%胎牛血清的DMEM，在每个培养板第一列分别加入不同的待测样品50 μL/孔，用50 μL多道移液器对血清样品进行3倍连续稀释至3-9，即所产生的稀释倍数为1/3，1/9，1/27，1/81，1/243，1/729，1/6561，1/19 683，弃掉最后一列孔中吸出的50 μL液体。

1.3.2抗体的中和 血清稀释完毕后，从-20 ℃冰柜中取出CAV-2-EGFP使其融化，用含3%胎牛血清的DMEM培养基将滴度为106.875TCID50/100 μL病毒稀释成100 TCID50/100 μL，100 μL每孔加入已有血清样品的细胞培养板中，置于37 ℃感作60 min(最多不超过90 min)。

1.3.3加入细胞 感作结束前10 min，消化MDCK细胞，加入适量DMEM，使细胞浓度达到5×104个/ml，每孔中加入50 μL细胞悬液，整个操作过程中枪头不应接触液面及孔壁。

1.3.4培养 将培养板置于37 ℃，5% CO2湿温培养箱中培养48 h。

1.3.5检测 于荧光显微镜下读取结果，以孔内完全没有荧光的血清稀释度作为最终中和效价，并将低于1∶27的最终中和效价视为阴性，即体内CAV中和抗体对表达RABV-G的CAV-2重组口服疫苗效果无影响。

1.3.6血清毒性对照：将3-1稀释的血清样品每孔100 μL加入微量细胞培养板中，于37 ℃感作60 min后，每孔加入50 μL细胞悬液，细胞浓度为5×104个/mL。

1.3.7空白对照 每孔加入250 μL细胞悬液，使细胞浓度达到5×104个/mL，且不加病毒及待测血清。

1.3.8阴性和阳性血清对照 与待检血清进行平行试验。

2 结 果

血清毒性对照显示，加入血清后，细胞长势良好，对试验结果无干扰。CAV-2-EGFP与梯度稀释的血清样品作用后，感染MDCK细胞48 h，在荧光显微镜下观察，显示无绿色荧光的证明病毒被该中和抗体完全中和，显示绿色荧光的证明病毒没有或者未完全被血清中的CAV中和抗体中和，该方法可直观有效的判定样品中CAV的中和抗体。CAV-2-EGFP被完全中和的临界条件是病毒能够被稀释后的样品抗体刚好完全中和，可以用以下公式表示N=3-k×A×p (N为病毒量，A为样品抗体含量，p为抗原抗体反应系数，3-*k为样品稀释度)。中和试验可以确定各血清样品荧光阴性的最大稀释度，见表1。

表1 血清最大稀释梯度下荧光阴性的样品数

根据本实验室研究经验，判定荧光阴性最大稀释度低于或等于3-3的样品为CAV中和抗体阴性，最大稀释度高于3-3的样品为CAV中和抗体阳性。其中，腺病毒中和抗体阳性率河北省犬只为18%，吉林省为7%，北京市为69%；腺病毒中和抗体阴性率河北省犬只为82%，吉林省为93%，北京市为31%。农村犬与城市犬CAV中和抗体有明显差异，农村犬只中腺病毒中和抗体阳性率为16%，阴性率为84%，城市犬中腺病毒中和抗体阳性率为69%，阴性率为31% 。

3 讨 论

近年来我国各地区频发恶犬伤人事件，犬只仍是主要传染源。目前已从鼬獾[11]，蝙蝠[12]等野生动物中分离出狂犬病毒，且今年台湾地区爆发跨种属的狂犬病疫情，引人关注。发达国家对犬的免疫率达到70%，即可有效控制狂犬病的扩散与传播[13]，但是很多原因使该目标在发展中国家难以实现[10]。其中包括：RV弱毒活疫苗接种动物后，可在体内繁殖，有毒力返祖的危险；传统的浓缩灭活苗需要多次免疫增加抗原接种量，以获得较强的免疫反应，从而导致成本增加，且免疫程序繁琐[3]；流浪犬及野生动物无法通过非口服免疫途径进行有效免疫。因此针对犬的口服免疫研究就显得尤为重要。

过去几十年中，口服疫苗在控制野生动物狂犬病中取得了较好的成绩。在欧洲，使用弱毒SAD株口服疫苗大量免疫狐狸，从而控制RABV向非疫区的扩散[14]，但是SAD株有引起啮齿类动物和家养动物发生狂犬病的危险。表达RVBV-G的重组痘病毒载体疫苗虽然对动物安全，但某些人群接触该疫苗免疫的动物可能引发强烈的皮肤炎症反应及一系列痘病毒感染症状[15]。

以CAV-2作为载体的口服狂犬疫苗避免了以上缺陷，但一些研究认为动物自然感染CAV引起过高的中和抗体会阻碍免疫[8]，甚至导致无法有效免疫犬科动物[10]。本试验对我国部分地区城乡犬只CAV中和抗体进行调查，其中农村自然感染CAV犬所占比例较低，仅为16%。而城市犬只多作为宠物犬，需要进行包括犬腺病毒在内的疫苗接种，因此城市犬体内普遍存在较高的CAV中和抗体(阳性率为69%)。由于已有试验证明，有效控制狂犬病在种群中的扩散需使种群免疫率达到70%以上[13]，因此对于存在众多流浪犬及家养犬的我国北方广大农村地区，因犬自然感染腺病毒率低，可以大量投放经济有效的表达RABV-G的CAV-2重组口服疫苗，而城市犬则主要通过非口服免疫突进预防狂犬病，从而降低整个地区狂犬病感染率。

参考文献：

[1]Zhou M, Zhang GQ, Ren GP. Recombinant rabies viruses expressing GM-CSF or flagellin are effective caccines for both intramuscular and oral immunizations[J]. PLoS ONE, 8(5): e63384. DOI: 10.1371/journal.pone.0063384

[2]Christine FG, Robert R, Dennis D, et al. Comparing onrab and raboral V-RG oral rabies vaccine filed performance in raccoons and Striped Skunks, New Brunswick, Canada, Maine, USA[J]. J Wildl Dis, 2012, 48(1): 157-167. DOI: 10.7589/0090-3558-48.1.157

[3]Esh JB, Cunningham JG, Wiktor TJ. Vaccine-induced rabies in four cats[J]. J Am Vet Med Assoc, 1982, 180: 1336-1339.

[4]Hu RL, Zhang SF, Fooks AR, et al. Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein[J]. Microbes Infect, 2006, 8: 1090-1097. DOI: 10. 1016/j.micinf.2005.11.007

[5]Li JW, Faber M, Papaneri A. A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice[J]. Virology, 2006, 356: 147-154. DOI: 10.1016/j.virol.2006.07.037

[6]Zhang S, Liu Y, Fooks AR, et al. Oral vaccination of dogs (Canisfamiliaris) with baits containing the recombinant rabies-canine adenovirus type-2 vaccine confers long-lasting immunity against rabies[J]. Vaccine, 2008, 26: 345-350. DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.11.029

[7]Qin JL. Study on PPR recombinant vaccine based on canine adenovirus type 2 and adeno-associated virus type 1 vector[D]. Changchun: Jilin University, 2013. (in Chinese)

秦俊岭. 基于犬2型腺病毒和1型腺相关病毒载体的小反刍兽疫重组疫苗的研究[D]. 长春: 吉林大学, 2013.

[8]Bru T, Salinas S, Kremer EJ. An update on canine adenovirus type 2 and its vector[J]. Viruses, 2010, 2: 2134-2153. DOI: 10.3390/v2092134

[9]Akerstedt J, Lillehaug A, Larsen I, et al. Serosurvey for canine distemper virus, canine adenovirus,Leptospirainterrogans andToxoplasmagondii in free-ranging canids in Scandinavia and Svalbard[J]. J Wildl Dis, 2010, 46(2): 474-480. DOI: 10.7589/0090-3558-46.2.474

[10]Wright N, Jackson FR, Niezgoda M, et al. High prevalence of antibodies against canine adenovirus (CAV) type 2 in domestic dog populations in South Africa precludes the use of CAV-based recombinant rabies vaccines[J]. Vaccine, 2013, 31: 4177-4182. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.06.089

[11]Zhang SF, Zhao JH, Liu Y, et al. Characterization of a rabies virus isolate from a ferret badger (Melogalemoschata) with unique molecular differences in glycoprotein antigenic site III[J]. Virus Res, 2010, 149: 143-151. DOI: 10.1016/j.virusres.2010.01.010

[12]Liu Y, Zhang SF, Zhao JH. Isolation of Irkut virus from aMurinaleucogasterbat in China[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(3): e2097. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002097

[13]Belotto A, Leanes LF, Schneider MC. Overview of rabies in the Americas[J]. Virus Res, 2005, 111: 5-12. DOI: 10.1016/j.virusres.2005.03.006

[14]Schneider LG, Cox JH, Muller WW, et al. Current oral rabies vaccination in Europe: an interim balance[J]. Rev Infect Dis, 1988, 10(Suppl 4): S654-659.

[15]Mempel M, Isa G, Klugbauer N, et al. Laboratory acquired infection with recombinant vaccinia virus containing an immunomodulating construct[J]. J Invest Dermatol, 2003, 120: 356-358. DOI: 10.1046/j.1523-1747.2003.12074.x