双碱基延伸法结合荧光偏振法快速检测新甲型H1N1耐药位点方法的建立

房师松，柴燕文，王 昕，吕 星，吴春利，程小雯，张仁利，薛 红，程锦泉

2.香港科技大学生命科学部应用基因组中心，香港 999077

随着达菲大量应用于临床，流感病毒在NA和HA上的耐药性突变株及耐药性突变位点逐渐增多［1］，特别是H275Y是近年来季节性H1N1流感病毒对达菲产生耐药性的主要分子机制［2－3］，流感病毒已在药物选择的压力下出现耐药现象，并呈扩散趋势［4－5］。自2009年6月WHO报道了第1例耐奥司他韦的甲型H1N1流感病例，截止到2010年5月已累计报道了290例对奥司他韦耐药的甲型H1N1流感病例，我国大陆也发现1例对达菲耐药的病例［6－7］。虽然耐药的甲型H1N1流感病毒目前只占很小的比例，但是英国和以色列已经报道了耐奥司他韦的甲型H1N1流感病毒在人与人之间能相互传播［8－9］。因此，目前的研究除了要准确检测甲型H1N1流感病毒之外，还应准确检测流感病毒的耐药位点是否发生突变，从而判断流感病毒是否已对达菲类药物产生耐药性。

本研究主要应用了新型的SNP基因分型技术：单荧光标记延伸的单核苷酸多态性位点检测方法——OLE（One－label extension）［10］，再结合荧光偏振技术，实现对耐药性位点基因型的快速分型，从而建立一种具有临床应用前景的高通量、高敏感性及特异性、操作简便、判读结果直观明确、检测费用低，能快速、准确检测流感病毒耐药位点突变的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 随机选取深圳市2009－2010年流感监测的甲型H1N1流感病例标本，细胞培养和鸡胚培养分离的流感病毒毒株为研究材料，共包括51株新甲型H1N1流感病毒，所有病毒都经实验确认型别和亚型。

1.1.2 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒购自瑞士Roche公司，One Step RNA PCR Kit（AMV）购自Takara公司，胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司，OLETMSNP Detection Kit Y－C/T 购自香港华晶基因技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 从GenBank随机下载30条甲型H1N1的NA基因序列，通过MEGA分析，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计引物。F1：5′－GCTGTCCTATTGGTGAAGTTCC－3′；R1：5′－CAGGAGCATTCCTCATAGTAATAATTAGGGGCATTCAT－3′；F2：5′－ATGAATGCCCCTAATTATTACTATGAGGAATGCTC－3′；R2： 5′－CCGCTATATCCTGACCACTCAT－3′；OLE引物（Sense）：5′－CGAAATGAATGCCCCTAATTAT－3′，OLE 引 物 （Anti－sense）：5′－AACAGGAGCATTCCTCATAGT－3′。1.2.2 病毒RNA的提取 病毒经MDCK细胞或9～11日龄鸡胚分离培养，使用 High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，操作方法详见试剂盒说明书。

1.2.3 NA基因待测样本、阳性和阴性对照样本的制备 由于甲型H1N1流感病毒H275Y位点发生突变的阳性样本难以获得，为了在检测时有阳性和阴性对照，利用重叠延伸PCR法进行定点突变的克隆。

1.2.3.1 RT－PCR 扩 增 按 Ta KaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）操作说明进行，50份待测样本用引物F1、R2进行RT－PCR扩增，NA基因突变位点阳性和阴性对照的克隆用引物组合（F1、R1）、（F2、R2）和（F1，R2）进行扩增，产物于1%浓度琼脂糖凝胶中电泳，分析产物。

1.2.3.2 NA基因阳性、阴性对照的克隆与鉴定参照QIAGEN Gel Extraction Kit说明书回收引物组合（F1、R1）、（F2、R2）和（F1，R2）的扩增产物，于1%浓度琼脂糖凝胶中电泳，分析回收的产物。引物（F1，R2）的RT－PCR回收产物为定点突变阴性对照。重叠延伸扩增（定点突变阳性对照）的反应体系为：10×EX Taq buffer 2.5μL，d NTP Mixture（各10 mmol/L）2μL，EX Taq 0.5μL，回收产物（F1、R1）1.5μL，回收产物 （F2、R2）1.5μL，F1（20 μmol/L）0.5μL ，R2（20μmol/L）0.5μL，RNase free H2O 16μL。反应条件：94℃2 min，（94℃30 s，50℃ 1 min，72 ℃ 1 min）循环5次，72 ℃ 10 min；加引物F1和 R2；94℃2 min，（94℃30 s，50℃50 s，72℃1 min）循环25次，72℃10 min。于1%浓度琼脂糖凝胶中电泳，分析重叠延伸扩增后的PCR产物，用胶回收试剂盒回收上述的PCR产物。

上述回收的阳性和阴性对照产物分别与PGEM－T载体在T4 DNA连接酶作用下16℃连接1 h，将连接产物转化于E.coliDH5α大肠杆菌感受态细胞中，挑单个菌落提取质粒，进行PCR和基因测序鉴定，筛选出阳性克隆子（PGEM－T－T）和阴性克隆子（PGEM－T－C）。

1.2.4 产物的纯化 利用OLETMSNP Detection Kit Y－C/T里的试剂纯化50份待测甲型H1N1流感病毒样本、PGEM－T－T和PGEM－T－C的PCR产物。反应体系为：5μL PCR产物，PCR clean－up Reagent 0.4μL，PCR clean－up Buffer 4.6μL，反应条件为：37℃45 min，85℃15 min。1.2.5 检测反应体系 采用OLETMSNP Detection kit Y－C/T试剂盒进行检测，反应体系为：10×Reaction buffer 2μL，OLE polymerase 0.3μL，Extension MixⅠ＆ Ⅱ 各1.5μL，OLE引物（5μmol/L）1μL，纯化产物2.5μL，RNase free H2O 12.7μL。反应条件为：95℃5 min，（95℃30 s，55℃30 s）循环30次，16℃保温。待测反应物避光放置于荧光偏振仪上进行检测。

1.2.5.1 纯化产物浓度的优化 在纯化产物中加入RNase free H2O，获得的浓度分别为800、400、200、100、50、25（ng/μL），同时进行 OLE反应，在荧光偏振仪上检测。

1.2.5.2 OLE sense和 Anti－sense引物信号对比

其他反应体系不变，分别加入OLE sense引物与OLE Anti－sense引物，同时进行OLE反应，在荧光偏振仪上进行检测。

2 结 果

2.1 RT－PCR扩增产物检测 用引物F1、R2扩增50份样本，经1%凝胶电泳确认，均获得733 bp的目的片段。

2.2 重叠延伸扩增产物检测 引物组合（F1、R1）、（F2、R2）和重叠延伸扩增产物（F1，R2）进行扩增，经1%凝胶电泳确认，产物的大小分别为364 bp、407 bp和733 bp，结果如图1所示。

图1 3对引物扩增NA基因M：100 bp DNA Marker；1：F1、R2扩增产物；2：F1、R1扩增产物；3：F2、R2扩增产物Fig.1 PCR amplification of three pairs of primers of NA geneM：100 bp DNA marker；1：PCR amplification with F1 and R2；2：PCR amplification with F1 and R1；3：PCR amplification with F2 and R2.

2.3 克隆子的测序结果 阳性克隆子（PGEM－TT）和阴性克隆子（PGEM－T－C）在第275位氨基酸突变位点的测序结果分别是T和C。

2.4 OLE反应中RT－PCR纯化产物浓度的优化分别做野生型（C）和突变型（T）的浓度优化，梯度为800、400、200、100、50、25（ng/μL），从实验结果可知，野生型（C）和突变型（T）的最佳浓度均为200 ng/μL。

2.5 OLE sense和 OLE anti－sense信号对比 分别做OLE sense和OLE anti－sense引物信号的对比，检测阴性对照和3份样本，结果如图2和3。从图中可知，OLE sense的信号明显强于OLE antisense的信号。

图2 利用OLE sense引物检测样本的FP值1：阴性对照；2～4：分别是3份待测样本Fig.2 FP value of sample with OLE sense primer1：Negative control；2－4：Three samples.

图3 利用OLE anti－sense引物检测样本的FP值1：阴性对照；2～4：分别是3份待测样本Fig.3 FP value of sample with OLE anti－sense primer1：Negative control；2－4：Three samples.

2.6 OLE－FP法检测50份样本的结果：待测的50份甲型H1N1流感病毒样本经RT－PCR、纯化后，利用OLE法检测第275位耐药位点发生突变的情况。从图4中可知，全部待测样本均是C，未发生T突变，说明未对达菲出现耐药现象。

50份样本的测序结果：为了验证OLE－FP法的准确性，同时对50份样本进行测序。

结果如图5所示。从图中可知，50份样本在第275位点的测序结果均是C，未发生T突变，这与OLE－FP法的检测结果一致。

3 讨 论

神经氨酸酶抑制剂是流感病毒神经氨酸酶竞争性可逆抑制剂，在低浓度下能抑制神经氨酸酶的活性，可作用于NA蛋白酶活性中心，能有效地阻断流感病毒的感染、复制和传播。研究表明NA基因的某氨基酸残基的突变可以使病毒对这类抗流感毒药物产生耐药性，包括E119V、R292K、R293K、N294S和H275Y，这些位点都直接或间接参与了神经氨酸酶的催化，一旦有氨基酸发生替换均会影响神经氨酸酶的活性，会对神经氨酸酶抑制剂产生耐药，特别是H275Y是近年来季节性H1N1病毒产生对达菲产生耐药性的主要分子机制［2－3］。

图4 OLE法检测50份样本的FP结果Fig.4 FP result of 50 samples with OLE method

图5 50份样本的正向测序结果TA－T：PGEM－T－T，阳性对照；TA－C：PGEM－T－C，阴性对照；OLE引物：OLE正向引物；01F～50F：50份样本编号正向测序Fig.5 Forward sequence result of 50 samplesTA－T：PGEM－T－T，positive control；TA－C：PGEM－T－C，negative control；OLE primer：OLE forward primer；01F－50F：Result of forward sequence of 50 samples.

目前，报道的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测方法非常多，但这些方法都存在一些问题。有些方法成本低，但速度慢，通量低，不适合自动化分析；有些方法可实现高通量检测，自动化分析，但设备与耗材的高昂价格，制备探针成本高，准确性低，并不适合像我国这样的发展中国家的需要。一个理想的检测SNP的方法必须具备以下优点：（1）适合自动化操作、简便、迅速；（2）分析费用低，特殊试剂用量少；（3）反应要严紧，样品纯度不高也可得到可靠的结果；（4）数据分析简单，易于自动化分析；（5）反应的通量要大而灵活［11］。到现在为止还没有一个符合以上条件的理想方法出现，因此，有必要通过进一步的优化和完善以往的检测方法，建立一种新型的SNP检测方法。

本研究中SNP两态性的检测在两个延伸反应中进行，每一个延伸反应检测其中一种等位基因。根据突变位点及其之后的第一个碱基的类型选择是以单碱基（single－base extension，SBE）还是双碱基（two－base extension，TBE）延伸模式进行反应，以渗入的荧光标记脱氧核苷三磷酸（R110－d NTP）产生的荧光偏振值（或称为荧光极化量）作为检测标准，然后再结合荧光偏振检测技术，实现对耐药性位点基因型的快速分型。

为了提高OLE－FP法检测结果判读的准确性，应用重叠延伸PCR法对第275位氨基酸的碱基进行定点突变的克隆，分别克隆阳性对照和阴性对照。此外，为了使该分型技术更能适用于甲型H1N1流感病毒耐药位点的检测，我们对RT－PCR产物纯化的浓度和OLE引物进行了优化，确定出最佳的OLE反应体系。同时，为了验证本方法检测结果的准确性，我们采用传统的Sanger测序法对耐药性位点的变异类型进行了测序，得到的第275位氨基酸里的碱基序列与OLE－FP法的检测结果一致，均为C，未出现T突变，提示达菲等神经氨酸酶抑制剂类药物对50份甲型H1N1流感病毒样本依然有效。

本研究以药物耐药位点的单个碱基突变为研究重点，应用OLE－FP法建立快速、特异、实用的突变位点检测方法，并将该方法应用于甲型H1N1流感病毒耐药性和突变位点的实时监测，可提前预防和控制新的流感流行特别是大流行的再次发生，同时，还能应用于指导临床治疗，快速筛选出抗流感病毒的药物，确定药物使用最佳剂量及制定出最佳治疗时间。该方法体系的建立，也可为其他耐药性检测特别是临床耐药性细菌的快速检测以及其他SNP相关疾病的临床检测提供技术手段，具有广泛的扩展性和相当高的临床应用价值。

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