恶性疟原虫对青蒿素类药物抗药性的最新研究进展

王颖娜，张艳梅，蔺应学，杨照青

疟疾(Malaria)是全球性严重危害人类健康的重要传染病之一，目前全球有90多个国家和地区的20多亿人居住在疟疾流行区。撒哈拉以南的非洲国家感染疟疾疫情最重，疟疾是非洲儿童死亡的最主要原因之一。东南亚的感染情况仅次于非洲，据世界卫生组织2008年的报告，全球30%的疟疾发病率和8%的死亡率集中在这里。虽然2010年世界卫生组织报告：疟疾发病案例由2005年2.44亿人次降到2009年2.25亿人次；死亡人数由2000年98.5万例降到2009年的78.1万例，其中非洲地区死亡人数虽然大幅下降[1]，但是目前疟疾仍然是世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，是威胁人类健康的主要疾病，给疫区带来沉重的经济负担，阻碍社会的发展。由于恶性疟发病凶险，愈后差，其病死率可高达50%，并且恶性疟原虫对多种抗疟药已存在耐药性，因此恶性疟已经成为一个严重的公共卫生问题。

自上世纪60年代以来，全球范围内恶性疟原虫对主要抗疟药物氯喹产生了抗药性，疟原虫的抗药性由单一性向多药抗性发展。恶性疟原虫抗药株的不断出现已成为重大的公共卫生问题，给疟疾防治工作带来新的挑战，疟原虫抗药性研究迫在眉睫。鉴于全球恶性疟原虫对传统的氯喹、乙胺嘧啶、甲氟喹等已产生耐药，由于具有抗药性疟原虫会很快遍布所有恶性疟流行地区，抗药强度会不断增加，原虫产生抗药性的速度远比新药研发的进度快得多，从保护青蒿素及其衍生物的角度考虑，世界卫生组织建议各国在青蒿素及其衍生物的基础上联合其他药物(ACTs)来治疗恶性疟，以延缓疟原虫对青蒿素和其他药物抗药性的产生。

1 青蒿素类药物抗药性的现状

青蒿素及其衍生物是一类全新结构的抗疟药，自其问世以来即以高效、速效、低毒的抗疟活性得到世界公认，对氯喹耐药的恶性疟依然有效。现在多重抗药的恶性疟原虫株已在东南亚和南美洲等地广泛流行，虽然疟原虫已对多种药物产生了抗药性，青蒿素类药物仍能够在几天内治愈超过90%的疟疾患者,目前被全世界公认为是一种很有效的抗疟新药，但是目前已有很多的研究提示青蒿素类药物的敏感性正逐渐下降，抗药性的产生是难以避免的。世界卫生组织曾经警告说,如果失去了ACTs，人们将再也没有一个治疗疟疾的办法，或许至少要用十年的时间才能发现一种新的抗疟药。

迄今为止，还没有文献报道恶性疟原虫对青蒿素类药物出现普遍的耐药性，但有报道称用青蒿素类药物治疗病人时已经出现了敏感性下降，寄生虫清除时间出现延迟和几周后再燃等情况[2-3]。最近在柬埔寨西部的Pailin和泰国Wang Pha同时做了一项治疗无并发症的恶性疟患者的研究，分为青蒿琥酯单药组和青蒿琥酯联用甲氟喹组两组，单药治疗组青蒿琥酯的剂量为2 mg/kg,d共7 d，联用组青蒿琥酯4 mg/kg,d共3 d，以后给甲氟喹25 mg/kg,分两次给药。在柬埔寨的Pailin寄生虫清除时间为84 h，泰国Wang Pha,为48 h[4]，在过去几十年的经验表明青蒿素类的药物可在两天时间内迅速清除血液寄生虫。排除了再次感染，在两地单用青蒿琥酯治疗组几周内分别有30%和10%的患者出现了症状复发的情况，而联合治疗组分别有10%和5%的病人再燃。Pailin和Wang Pha真正的失败率可能分别高达20.0%和37.5%[4]。2004年柬埔寨第1次报告用青蒿素治疗恶性疟出现耐药以来[2-3]，许多在泰国-缅甸边境上出现的“新感染疟疾”病例，实际上很可能是再燃。在缅甸南部还有另一项研究对青蒿琥酯治疗无并发症疟疾患者，治疗72 h后进行寄生虫清除半衰期的分析，表明72 h后有26.9%仍可检测出原虫。这是第一次报告青蒿素耐药性起源在缅甸境内[5]，这些研究提供的证据表明在缅甸的恶性疟原虫很可能对青蒿素敏感性降低。在泰国边境，甲氟喹，青蒿琥酯在体内的疗效逐步下降，有研究报告用青蒿琥酯治疗恶性疟病人，治疗第3 d患者的外周血疟原虫阳性率2011年达到28%，而2000年同样用青蒿琥酯治疗病人，3 d后患者外周血疟原虫阳性率为0%[6]。恶性疟原虫于青蒿素类药物治疗3 d后血液中仍然可以观察到较多寄生虫，这就是“延迟疟原虫转阴时间”。还有研究表明，经过在泰国青蒿素治疗后第2 d、第3 d可见疟原虫的比例约30%和15%，第28 d有2%可见疟原虫[7]。柬埔寨西部的Pailin，患者经青蒿琥酯单药治疗或甲氟喹，青蒿琥酯治疗2 d后外周血涂片见寄生虫的比例高达73%，治疗3 d后患者外周血涂片见到疟原虫的比例为55%[7-8]。疟原虫清除时间延长在越南也有报道[9]，但相关研究仍在继续，有待于进一步监测及证实。

恶性疟原虫对青蒿素类药物出现敏感性降低的现象在亚洲比较突出，而在非洲则不同。在西非马里共和国(RépubliqueduMali)的研究指出，在这项青蒿素耐药性的研究患者外周血中疟原虫转阴时间的中位数为32 h[10]，远低于柬埔寨西部报告时间。可能的原因为马里2004年以后才广泛使用青蒿素类药物，而柬埔寨使用这类药物超过30年，在马里疟疾病人得到青蒿素及衍生物治疗的比例远低于柬埔寨西部，另外马里大量恶性疟疾病例主要为输入性病例，病人不会自行用药，这些因素可能使得马里的疟原虫未对青蒿素类药物长沙耐药[10]。

2009年杨恒林等[11]采用WHO推荐的体外微量法做了缅甸拉咱地区恶性疟原虫对青蒿琥酯等7种药物体外半数抑制量(ID50)测定，发现缅甸拉咱地区恶性疟原虫对青蒿琥酯的ID50为299.2 nM/L比1993年作者在该地区做的IC50上升1.2倍，提示青蒿琥酯对恶性的敏感性呈下降趋势。另一项研究[12]用双氢青蒿素哌喹片(每片含双氢青蒿素40 mg， 磷酸哌喹320 mg) 2 d 4次疗法治疗缅甸拉咱市恶性疟原虫感染阳性者91例，64 例全程随访者中，尚有4 例(6.3%)于服药后第3 d外周血中疟原虫未转阴，但因这4例病人腋温小于37.5 ℃仍判为临床治疗有效，这4 例患者服药后随访外周血无性体原虫转阴时间为65.9 h，比研究者在云南观察的最长无性体原虫转阴时间(63 h)长，这可能与当地恶性疟原虫对哌喹和青蒿素类敏感性下降有关，推测当地部分恶性疟原虫可能对双氢青蒿素哌喹片敏感性下降[12]。

2 青蒿素类药物抗药性可能的机理

耐多种抗疟药的恶性疟原虫是全球疟疾控制的一个主要障碍。虽然青蒿素类药物抗性关联基因研究被人们进行很多探索，但是到现在为止仍然没有明确的结论。恶性疟原虫耐抗疟药乙胺嘧啶、磺胺、氯喹与特定的pfdhfr，pfdhps和Pfcrt基因突变相关。然而，有相当大的争议为新兴突变的耐青蒿素类抗疟药衍生药物标记。一些观察表明青蒿素抑制恶性疟原虫胞浆网织钙依赖性ATP酶(sarco/endoplasmic calcium-dependent ATPase 6,PfATPase6)，有资料[13]表明，青蒿素类药物可以抑制在非洲爪蟾卵细胞内表达Pfatp6的酶活性，如果在该酶的第三跨膜区引入L263E这一突变，则解除了青蒿素类药物对该酶的抑制。jambou[14]等，报道了位于沿巴西北部边境的圭亚那从恶性疟患者体内分离出的虫株对蒿甲醚的IC50值有所升高，通过测序，他们发现Pfatp6的第769位的丝氨酸突变为天冬酰胺，提示Pfatp6基因的突变可能会使疟原虫对青蒿素的敏感性降低。虽然这种突变的意义还未确定，这些观察可能表明S769N突变可能是一个药物抗性标记[15]。值得注意的是，大部分的Pfatp6突变是具有地域局限的[16]。现仍需要进一步的研究，找出能够可靠预测的青蒿素耐药性的分子标记。目前，对这个观点持否定态度的有所增加[17]。

2010年美国的一个学者提出，ACT(artemisinin combination therapy)疗效的下降，和Pfmdr1基因型有关[18]。pfmdr1的基因拷贝数增加，不论在体内还是体外实验，都是甲氟喹和卤泛群的抗性的主要决定因子[19]。在东南亚，特别是泰国和柬埔寨的一些地区，高水平的分离与pfmdr1拷贝数大于1(30%～40%)是由于MQ单药治疗多年，作为第一线治疗无并发症恶性疟疾。抗疟疾药物滥用可能导致株扩增pfmdr1的患病率快速增加，因为所有疟疾流行地区，疟疾在非洲的传输水平是最高的。这种情况可能加速耐药性的出现行为[24]。作为一个概念证明，研究者用7 d的本芴醇浓度测量估计再感染成倍增加恶性疟原虫浓度，多药耐药基因(pfmdr1)基因型与药敏的结果。研究结果发现，再次感染寄生虫pfmdr1单体型的N86/184F/D1246种能够承受本芴醇血药浓度高于15倍那些与86Y/Y184/1246Y的单倍型。该方法可应用于长半衰期抗疟疾药物，能及早发现恶性疟原虫体内的药物敏感性降低，这代表一种新的抗疟药耐药的分子标记方式[21]。

到今天为止，上述观点仍一直存在争议，分子基础耐药机制仍不清楚。柬埔寨泰国边境上出现的青蒿素耐药性的威胁已得到广泛承认，虽然最终明确的恶性疟原虫感染，大多数仍然以青蒿素为基础的联合疗法治疗，耐药的恶性疟原虫清除时间需要3或4 d，而青蒿素敏感的疟原虫虫清除时间不到2 d。防止青蒿素耐药性的蔓延是疟疾防治的重大课题[22]。

有报道[273〗指出，在柬埔寨西部青蒿琥酯治疗恶性疟疾的失败率增加，也就是说青蒿素类药物已经被发现敏感性下降，其可能的机制是寄生虫生长休眠情况。休眠恢复假说为寄生虫在人体内经过药物作用后进入静止状态或者休眠，等青蒿素类药物的短的药物药效高峰期过了以后，才进一步发育，这样的一个发育滞后，恰恰保护他们免受药物致死效果。最近有研究表明，在双氢青蒿素作用下恶性疟原虫很容易进入休眠期。与其他药物相比，较长半衰期的药物则不容易进入休眠期[23]。法国和美国科学家亦发表了类似研究结果。

休眠现象实际就是寄生虫的一种自我保护现象。对于恶性疟原虫来说，其表现就是恶性疟原虫在人体内的清除延迟。尽管清除延迟一直使原虫复燃的风险增高，但临床疟疾却没有体现出治疗失败现象[23]。

如果确定休眠现象是青蒿素耐药性真正的原因，我们在临床治疗时，就可以根据此机制更灵活的运用并治疗。休眠现象被认为更多的存在于短期疗效的药物中，此时我们的治疗就可以青蒿素短期疗效结合长效药，以这样的联合用药为治疗的主导地位。

3 结 语

疟疾在全球致死性寄生虫病中位居第一位[24]。青蒿素类药物作为一种全新抗疟药, 以其优良的疗效和低毒性而成为全世界最常用的抗疟药。世界已有多个地区报道恶性疟原虫对青蒿素类药物的敏感性下降,寄生虫在人体内清除率时间延长。让从事疟疾防治的工作者真正认识到恶性疟原虫对青蒿素产生抗药性的危害，对延缓疟原虫对青蒿素类药物耐药产生意义重大。

虽然青蒿素耐药性机制近期被多方研究探索，如Pfatp6基因突变、Pfmdr1基因突变，以及研究最热的寄生虫休眠假说等等，但是到现在仍然没有确定，有待进一步的研究探索，解开青蒿素耐药之谜，延长青蒿素类药物使用寿命和减缓耐药性,使疟疾的治疗没有后顾之忧。

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