孕妇血浆中胎儿游离DNA检测在唐氏综合征产前诊断中的应用

赵光坚

（广东省广州市天河区妇幼保健院，广东 广州 510627）

孕妇血浆中胎儿游离DNA检测在唐氏综合征产前诊断中的应用

赵光坚

（广东省广州市天河区妇幼保健院，广东 广州 510627）

目的探讨检测孕妇血浆中胎儿游离DNA在诊断唐氏综合征中所发挥的作用。方法随机选取2011年2月至2012年2月在我院进行产前检查的孕妇40例，其中包括正常产检、高龄或唐氏综合征需实施羊水穿刺的高危孕妇等，分为正常男胎妊娠组15例，正常女胎妊娠组13例，唐氏综合征男胎妊娠组12例。通过实时定量的PCR技术，对孕妇血浆中胎儿游离DNA水平变化进行检测比对。结果正常男胎妊娠组及唐氏综合征男胎妊娠组均检测出DYS14基因及β-actin基因，正常女胎妊娠组因无Y染色体，未检出DYS14基因。正常男胎妊娠组的DYS14基因定量数值为（31.9±17.6）GE/mL，范围分布为23～66 GE/mL，而唐氏综合征男胎妊娠组的DYS14基因定量数值为（74.6±31.2）GE/mL，范围分布为56～108 GE/mL。结论采用实时定量的PCR技术，对孕妇血浆中胎儿游离DNA进行检测，是一种较为操作快捷、经济合理的非创伤性产前筛查。

唐氏综合征；胎儿；游离DNA；产前检查；PCR

唐氏综合征，又名21三体综合征或先天愚型，是一种最为常见的先天性染色体非整倍体遗传疾病，多发于高龄产妇，发病率约在1/600～1/800，此类新生儿往往面容特殊，存在较为严重的智力障碍，并伴有先天性心脏病等各类畸形病症，并增大了患有白血病的概率，由于尚无切实有效的治疗方法[1]，容易给家庭带来较大的经济压力以及精神痛苦，也容易给社会带来沉重的负面效应，因此较为切实可行的有效措施是出生干预。本文通过使用实时定量的PCR技术，对孕妇血浆中胎儿游离DNA水平进行测定，探讨一种方便快捷、经济合理的非创伤性产前筛查方法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2011年2月至2012年2月在我院进行产前检查的孕妇40例，其中包括正常产检、高龄或唐氏综合征需实施羊水穿刺的高危孕妇等，分为正常男胎妊娠组15例，正常女胎妊娠组13例，唐氏综合征男胎妊娠组12例。三组孕妇平均年龄均为（30±4）岁，平均孕周为（19±3）周，均未有妊娠合并症且均为初产。

1.2 检测方法

1.2.1 制备样本

抽取5 mL孕妇外周血，置入含有乙二胺四乙酸抗凝剂的无菌管内，离心10 min，转速设定为2000转/分，将上层血浆吸取置入无菌Eppendorf离心管内，离心10 min，转速设定为13000转/分，再将上层血浆吸取分装，置入-80 ℃的冰箱中冻存备用。

1.2.2 提取胎儿游离DNA

取出待检的血浆400 μL，采用德国Qiagen公司生产的DNA提取试剂盒进行DNA的提取，并使用缓冲剂50 μL洗脱每份DNA标本。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测（Taqman探针法）

分别对DYS14基因以及β-actin基因进行扩增，操作方法为：DYS14基因：温度94 ℃，共计用时5 min，循环数为40次，其中94 ℃变性15 s，退火/延伸温度55 ℃ 15 s，60 ℃ 50 s；β-actin基因：温度94℃，共计用时5 min，循环次数为 40次，其中94 ℃变性15 s，退火/延伸温度60 ℃，时间60 s。每完成1个循环，自动进行1次荧光值检测。

各反应管中荧光信号抵达预先设定好的荧光阈值时所需要的循环数即为CT值，每一模板的CT值同此模板的起始拷贝数对数呈线性关系，通过起始拷贝数已知的标准品进行标准曲线的制作，并利用标准曲线，根据待测样本测定出的CT值确定出样本的DNA含量，然后以每个细胞中6.6 pg DNA为基准，将每毫升血浆中含有的DNA拷贝数换算出来，单位为GE/mL[2]。

1.3 统计学处理

采用SAS 9.0软件包进行数据处理，通过t检验。

2 结 果

3组孕妇均检出β-actin基因。15例正常男胎妊娠组和12例唐氏综合征男胎妊娠组均检出DYS14基因，特异性和敏感性均达到100%。正常女胎妊娠组由于不存在Y染色体，未能检出 DYS14基因。其中正常男胎妊娠组的DYS14基因定量数值为（31.9±17.6）GE/mL，范围分布为23～66 GE/mL，而唐氏综合征男胎妊娠组的DYS14基因定量数值为（74.6±31.2）GE/mL，范围分布为56～108 GE/mL（P＜0.01）。

3 讨 论

3.1 游离DNA的发现及来源

几十年前，已有研究人员发现人体的外周血中存在着微量游离核酸，不久之后，通过肿瘤患者的外周血检测出具备肿瘤特征的游离DNA，并证明大多数游离DNA来自肿瘤细胞[3]。而在妊娠这一过程中，胎盘滋养层浸润子宫壁与肿瘤细胞侵入的机制极为相似，差异在于胎盘滋养层的浸润具备空间及时间特性。从免疫学的角度来看，胚胎和母体的关系，也与肿瘤和机体的关系相类似，在这一发现的启发下，研究人员推测，在孕妇的外周血肿应同样存在着胎儿的游离DNA，在随后的研究中，成功地采用实时荧光定量PCR技术，从孕妇血浆中的游离DNA中扩增获得男性胎儿的SRY基因序列，证明胎儿的DNA能够以游离DNA的状态进入孕妇的外周血循环中，并稳定存在[4]。

在进一步的研究中，研究人员发现，胎儿游离DNA的来源以及释放机制大致包括下列3种：①进入孕妇外周血的胎儿有核细胞凋亡，释放游离DNA。这部分细胞包括淋巴细胞、有核红细胞、粒细胞等，进入情况包括滋养层基膜及绒毛毛细血管的内皮组织等几种类型，在这一过程中，胎儿的有核细胞可能出现凋亡。然而经过进一步检测发现，孕妇外周血中含有的胎儿有核细胞数量较少，而血浆中的游离DNA含量却较为丰富，尤其是早产孕妇的血浆中，胎儿的有核细胞数量未见增加，游离DNA的含量却有显著的增高，分娩2 h后，胎儿游离DNA便全部消失，胎儿有核细胞却能够在母体血浆中存活27年，因此孕妇血浆中源自胎儿有核细胞的胎儿游离DNA比例较小；②通过母胎界面进入孕妇外周血。经检测羊水中胎儿游离DNA的浓度较孕妇血浆中的浓度高近200倍，但脐血浆中母源性DNA的含量在胎儿血循环中总游离DNA的比例平均仅为0.9%，而孕妇血浆中的胎儿游离DNA含量占母体血循环中总游离DNA的比例平均为14.3%，因此即便胎儿游离DNA能够穿过胎盘，也不可能是孕妇血浆中胎儿游离DNA的主要来源；③胎盘滋养层的细胞凋亡，释放胎儿游离DNA。胎盘滋养层是一种胎源组织，承担着母体和胎儿间物质交换的作用，当孕期为4周时，母体血液将滋养层的间隙完全充满，令滋养层细胞能够侵入子宫基层，故而合体滋养层细胞便有可能深入母体血液之中，在整个妊娠期间，胎盘细胞均在不断凋亡，而超过50%的凋亡细胞是滋养层细胞，这是由于胎盘在妊娠早期时所处的环境始终相对缺氧，因此造成大量的滋养层细胞因缺氧而凋亡，释放出的膜包裹凋亡小体中含有大量DNA。由此可见，孕妇血浆中胎儿游离DNA的主要来源，便是凋亡的胎盘滋养层细胞。

3.2 胎儿游离DNA的制备分析

本次研究通过两步离心法对待测样本进行处理，分第一次离心将血浆及红细胞、淋巴细胞等成分沉淀分离开来，第二次利用超高速离心的方法，将血浆中滞留的少量细胞成分完全分开，获得纯净的血浆样本，确保了在产前筛查以及诊断过程中样本的可靠性，同时证实，利用孕妇血浆中的胎儿游离DNA进行产前筛查以及诊断，比使用胎儿细胞更加具有优势。

使用Taqman探针法的实时荧光定量PCR技术，能够实时监测每一次的PCR循环，对样本起始模板中拷贝数量的测定更加准确，与传统PCR技术相比，避免了以终产物做定量测定而造成的偏差。同时，由于Taqman探针的灵敏性和特异性极高，假阳性的发生率较低，因此使测定工作更加准确、高速。此外，通过本次研究发现，利用实时荧光定量PCR操作便捷、使用安全、污染度低、高自动化、高通量、高效率，能够在2～3 h内完成近百个样本的定量分析工作，适合大规模的产前筛查及病情诊断工作。

在本次对于唐氏综合征男胎妊娠的临床诊断工作中，采用孕妇血浆中胎儿游离DNA检测的方法，检测结果为（74.6±31.2）GE/mL，与正常男胎妊娠组的（31.9±17.6）GE/mL相比，高出2～3倍，由此可以证实，唐氏综合征男胎妊娠组孕妇血浆中的胎儿游离DNA的含量会出现明显的增加，结合孕妇外周血中胎儿游离DNA来源的研究可以得出结论，检测胎儿游离DNA能够作为筛查和诊断唐氏综合征的候选指标。

综上所述，采用实时荧光定量PCR技术对孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测，具有准确、便捷、安全、高效、高通量等诸多优势，值得在临床诊断及检测工作中大力推广。

[1] 宋桂红,田立霞.胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用[J].国际生殖健康计划生育杂志,2008,27(4):237-239.

[2] 李子军.胎儿有核红细胞与无创性产前诊断[J].国际妇产科学杂志,2008,35(6):398-401.

[3] 李敏清.绒毛活检在产前诊断中的应用[J].广西医科大学学报,2008,25(6):978-980.

[4] Engel K,Plonka T,Bilar M,et al.The correlation between clinical characteristics of pre-eclampsia and the concentration of fetal DNA in maternal circulation[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2008,139(2):256-257.

Detection of Pregnant Women Cell-free Fetal DNA in Plasma in the Application of the Prenatal Diagnosis of Down's Syndrome

ZHAO Guang-jian
(Guangzhou Tianhe District MCH Hospital, Guangzhou 510627, China)

ObjectiveTo evaluate the detect pregnant women cell-free fetal DNA in plasma of the role in the diagnosis of down syndrome.MethodsRandomly selected from February 2011 to February 2011 in our hospital antenatal examination of pregnant women 40 cases, including normal prenatal, old age or down syndrome need to implement an amnio high-risk pregnant women, divided into normal male pregnancy group and control group, 15 cases of normal female pregnancy group of 13 cases, 12 cases of down syndrome male pregnancy group. Through real time quantitative PCR technology for pregnant women to detect cell-free fetal DNA in plasma level changes.ResultsNormal male pregnancies and down's syndrome male pregnancy group were detected DYS14 gene and beta actin, normal female pregnancy because there was no Y chromosome, DYS14 gene was not detected. Normal male pregnancy group DYS14 gene quantitative values for GE/mL (31.9±17.6), the scope of distribution of 23-66 GE/mL, and down syndrome pregnancy group male DYS14 gene quantitative values for GE/mL (74.6±31.2), the scope of distribution for 56-108 GE/mL.ConclusionUsing real-time quantitative PCR technique, cellfree fetal DNA in plasma were detected for the pregnant woman, is a more efficient, economic and reasonable operation of non invasive prenatal screening.

Down's syndrome; Fetuses; Cell-free DNA; Antenatal examination; PCR

R714.53

B

1671-8194（2014）16-0011-02