原发性胆汁性肝硬化所致肝癌患者自身抗体特征分析

李卓敏，赵丹彤，冯 霞，孙丽梅，张海萍，赵 艳，闫惠平

(首都医科大学附属北京佑安医院 自身免疫性肝病研究中心，北京100069)

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一种原因不明的慢性进行性自身免疫性肝病，病理学表现为肝内小叶间胆管非化脓性慢性进行性破坏，最终导致肝纤维化和肝硬化的疾病，约90%的PBC患者为女性，多在中年诊断出该病。PBC疾病进展的最终结果为不可逆转的胆汁性肝硬化，肝移植为肝功能衰竭的最终有效治疗手段。尽管在PBC患者中肝衰竭意味着疾病进展的最终阶段，但也有报道在PBC患者中有0.76%-5.9%的发展为肝细胞癌[1-4]。近年来随着PBC患者治疗状况好转及生存率的提高，PBC合并发生HCC值得加以重视及研究。对于PBC伴肝癌病例国内报道较少，本研究团队总结分析了近年来收治的350例PBC患者，并对其中确诊肝癌的9例患者的自身抗体特征进行了分析,报道如下。

1 材料与方法

1.1研究对象

研究对象来自2007年-2012年于北京佑安医院住院收治的PBC患者，共350例，其中9例患者合并肝癌。PBC诊断标准符合2009年美国肝病学会(AASLD)制定的PBC诊断标准，包括：1)ALP等反映胆汁淤积的生物化学指标升高；2)AMA或AMA-M2阳性；3)如血清AMA或AMA-M2阴性，病理诊断有非化脓性胆管炎和中小胆管破坏。同时排除病毒性肝炎，酒精性及药物性肝损害。上述标准满足2条即可[5]。

1.2方法

1.2.1 间接免疫荧光法(IFA，德国EUROIMMUN公司试剂)检测患者的抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗细胞骨架抗体(CS)、抗肝肾微粒体(LKM)等自身抗体。患者血清自1∶100起稀释，操作步骤严格按欧蒙公司生物玻片马赛克TM技术试剂盒说明书进行，封片后荧光显微镜观察结果，组织或细胞内出现特征性绿色荧光，血清稀释度≧1∶100为阳性。

1.2.2 免疫印迹法(德国EUROIMMUN公司试剂)检测抗核抗体谱，检测膜条包被抗原有:抗核糖核蛋白(nRNP)、抗史密斯抗体(Sm)、抗干燥综合征抗原A抗体(SS-A)、抗Ro52抗体、抗干燥综合征抗原B抗体(SS-B)、抗硬皮病70抗体(Scl-70)、抗Jo-1抗体(Jo-1)、抗着丝点蛋白B抗体(CENP B)、抗gp210抗体、抗Sp100抗体，操作严格按照说明书进行。检测膜条出现蓝紫色条带为阳性。

1.2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测AMA-M2亚型抗体，>25RU/L为阳性。

1.2.4 微粒子酶免疫法(MEIA，美国雅培试剂盒)检测患者血清AFP(正常值为0-7 ng/ml)。

1.3统计学处理

采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据处理采用χ2检验

2 结果

2.1PBC患者中HCC发生率

本研究共收集PBC患者350例，女性293例(83.7%)，男性57例(16.3%)，平均年龄56岁(24-90岁)。PBC合并肝癌患者9例,发生率为2.57%(9/350)，其中女性2.38%(7/293)，男性3.5%(2/57)，9例HCC患者平均年龄67岁(52-87岁)。

2.2 9例PBC合并HCC患者自身抗体检出情况

2.2.1 自身抗体检出率：在HCC的诊断时间点检验结果提示：9例PBC患者8例AMA检测阳性(另1例病史中AMA曾经阳性，肝穿诊断为PBC)； 8例AMA-M2阳性；9例患者ANA检测均阳性；9例患者均未检出抗-LKM及SMA阳性。8例患者(88.9%)至少同时检出两种自身抗体阳性(ANA/AMA)。

2.2.2 自身抗体滴度分布： 9例HCC患者中8例AMA检测阳性，其中4例(50%)滴度≧1∶1000，3例(37.5%)滴度1∶320，1例滴度1∶100，(另1例患者在诊断PBC时AMA 1∶320，诊断HCC时AMA阴性)。9例患者ANA检测阳性者中8例滴度≧1∶1000，1例1∶100； 1例ACA阳性患者，滴度≧1∶1000。

2.2.3 ANA荧光核型：9例ANA阳性患者荧光核型多为混合型：单独核膜型、着丝点型各1例，颗粒型2例；核膜/核点型2例，颗粒/核点型3例。

2.2.4 抗核抗体谱检测：9例患者中1例CENPB阳性(65岁女性)，1例SSA阳性(61岁女性)，1例Scl-70阳性(52岁女性患者)。2例gp210阳性(分别为62岁男性1例及52岁女性患者1例)。其余种类抗体为阴性。

2.3 9例HCC患者AFP检测结果及与自身抗体关系

9例中7例AFP升高(其中2例患者血清AFP值≧200 U/L,其余5例患者血清AFP值均小于100 U/L)、2例AFP正常。8例AMA阳性的患者M2均阳性，其滴度与血清AFP含量并无直接相关性。9例患者ANA均阳性，AFP值升高的7例患者其滴度在整个病程中变化不大。AFP正常的1例患者ANA滴度随病程发展逐渐上升(诊断PBC时1∶100,诊断HCC时≧1∶3200)。就ANA荧光核型来讲，9例患者均以混合核型为主。

3 讨论

PBC是一种自身免疫相关的胆汁淤积性肝病，其病因不明，发生肝癌的病因也有待研究。原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，年死亡率占全部恶性肿瘤的18.8%，诊断明确的肝癌患者生存期通常少于1年，肿瘤转移和复发是肝癌患者的主要死因[6]。在我国，导致原发性肝癌的最常见的原因为乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染，HBV感染者后肝硬化中HCC年发生率3%-6%[7]，HCV感染后肝硬化中HCC年发生率为1%-7%[8]。而PBC是一种相对少见的肝病，其发生肝癌的发病率在我国还未见报道。本文以较大样本报告2007-2012年5年间在佑安医院收治的350例PBC患者，其中肝癌的发生率为2.57%。

9例PBC合并HCC的患者中主要检出了ANA、AMA及ACA等几种自身抗体，AMA及ANA抗体滴度以高滴度为主，其中88.9%(8/9)患者AMA及AMA-M2检测阳性，与既往研究报道[9]90%的PBC患者血清学检测可见AMA及AMA-M2阳性类似。9例患者ANA检测阳性率为100%，比闫惠平等[10]研究报道78%阳性率偏高，可能与合并HCC有关。有研究得出，ANA具有抗肿瘤活性，可能机制为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用，ANA免疫复合物诱导机体产生增强免疫功能的细胞因子，以及ANA与肿瘤凋亡释放到细胞外的核染色质结合，消除或降低了细胞外染色质对NK细胞杀伤瘤细胞活性的抑制作用[11]。本研究中ANA靶抗原可见CENP-B、Scl-70、SS-A及gp210等为阳性，可能提示这些患者重叠其他自身免疫性疾病的可能，这似乎提示PBC合并其它自身免疫性疾病似乎与患者发展为HCC并无关联性。9例患者ANA核型以混合荧光核型出现较常见，主要为核膜/核点型、颗粒/核点型。闫惠平等[10]对52例PBC患者ANA分析发现，细胞核膜型、着丝点型和细胞核点型为PBC患者的主要荧光模式，周仁芳等[12]分析所得PBC患者ANA荧光核型以核膜型及着丝点型为主要核型。本研究中所得荧光模型基本符合既往PBC核型研究，以混合核型多见，可能与患者合并HCC相关，对比以往研究着丝点型比例较低，有待进一步扩大样本量以证实。

AFP为诊断HCC较为可靠的指标之一，本研究的9例患者均进行了AFP的检测。结果显示AFP升高的7例患者ANA滴度以1∶1000高滴度为主且病程发展过程中变化不大。检测结果提示肝癌患者自身免疫反应强弱似乎可体现在AFP含量上，就个案来讲，其中1例女性患者AFP逐渐升高的过程中，其ANA滴度从1∶1000降至1∶320，AMA滴度从1∶1000降至1∶100。AFP含量始终正常的1例女性患者在疾病进展过程中ANA滴度从1∶100逐渐升至≧1∶3200，这可能提示我们在AFP水平在升高过程中机体自身免疫反应减弱。这似乎也可解释本研究中ANA的高检出率。PBC患者血清AFP含量高低与ANA滴度及核型之间的关系还有待进一步扩大样本量来验证。

作者简介：李卓敏(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：原发性胆汁性肝硬化。

参考文献：

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[3]Miyake Y,Iwasaki Y,Terada R,et al.Persistent elevation of serum alanine aminotransferase levels leads to poor survival and hepatocellular carcinoma development in type 1 autoimmune hepatitis[J].Aliment Pharmacol Ther,2006,24(8):1197.

[4]Nakano T,Inoue K,Hirohara J,et al.Long-term prognosis of primary biliary cirrhosis(PBC) in Japan and analysis of the factor of stage progression in asymptomatic PBC(a-PBC)[J].Hepatol Res,2002,22(4):250.

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[10]闫惠平，庄 辉，刘燕敏，等.原发性胆汁性肝硬化患者的免疫学特点分析[J].中华肝脏病杂志，2005,13(1)：12.

[11]Torchilin VP,Iakoubov LZ,Estrov Z,et al.Antinuclear autoantibodies as potential antineoplastic agents[J].Trends Immunol,2001,22(8):424.

[12]周仁芳，胡朝军，张蜀澜等.临床标本抗核抗体102651例检测结果回顾性分析[J].中华检验医学杂志，2009,32(12)：1339.